Флюорографический метод определения в моче по Эйлеру и Лишако в модификации Э. Ш. Матлиной. После адсорбции и элюции адреналин и норадреналин превращаются во флуоресцирующие производные адренолютин и нор-адренолютин и различаются по различным максимумам возбуждения и испускания флуоресценции.
Необходимые реактивы: 1) этилендиаминтетраацетат; 2) окись алюминия; 3) 1 н. и 5 н. едкий натр; 4) 1 н. гидроокись аммония; 5) 0,25 н. уксусная кислота; 6) 0,25%-ная красная кровяная соль; 7) перекристаллизованная аскорбиновая кислота; 8) кристаллический адреналин; 9) кристаллический норадреналин.
Метод определения. Из суточного количества мочи отбирают 100 мл, кипятят и фильтруют. К 25 мл фильтрата добавляют 50 мг этилендиаминтетраацетата, который тщательно перемешивают до полного растворения. Раствор нейтрализуют добавлением по каплям 1 н. едкого натра (приблизительно 1,5—3,0 мл) до рН 8,2. После этого нейтрализованный фильтрат пропускают через хроматографическую колонку длиной 25 см с расширением в верхней части на 50 мл. Высота столба до крана 17 см, внутренний диаметр 9,8 см. На дно колонки над краном помещают кусочек стеклянной ваты и при закрытом кране наливают 10 мл воды, в которую насыпают 1,0 Al2O3. После отстаивания осадка воду спускают и в колонку наливают исследуемый раствор. Скорость фильтрации 1—2 мл в минуту. После прохождения фильтрата адсорбент промывают 10 мл воды, подщелоченной одной каплей 1 н. гидроокиси аммония. Предварительно этой водой ополаскивают колбочку, в которой находится нейтрализованный фильтрат мочи.
Элюция производится 10 мл 0,25 н. уксусной кислоты, двумя порциями по 5 мл. При добавлении первых 5 мл кран закрывают и осадок перемешивают стеклянной палочкой. После того как осадок вновь осядет (3—5 минут), кран открывают и элюат собирают в пробирку. Затем через колонку пропускают еще 5 мл кислоты (без перемешивания осадка), которую собирают в тот же приемник. Из собранного элюата отбирают 4 мл, рН доводят при помощи Г мл 1 н. гидроокиси аммония до 6,3—6,4. Нейтрализованный элюат разливают в две опытные параллельные и одну контрольную пробирки по 1 мл. В первые две пробирки добавляют по 0,1 мл 0,25%-ного раствора красной кровяной соли и через 2 минуты 1 мл 0,2%-ного свежеприготовленного раствора аскорбиновой кислоты на 5 н. едком натре. В контрольную пробу добавляют то же количество щелочи и аскорбиновой кислоты, но без красной кровяной соли.
Объем всех пробирок доводят водой до 10 мл. Через 2—3 минуты измеряют флуоресцирование. В опытных пробах при окислении кровяной соли образуются адренохром и норадренохром, а при добавлении щелочи с аскорбиновой кислотой они превращаются в соответствующие лютины. В контрольной пробе адреналин и норадреналин прямо переходят в нефлуоресцирующие продукты окисления.
Стандартные растворы готовятся каждый раз из кристаллических препаратов при определении адреналина и норадреналина. Основные растворы адреналина и норадреналина с концентрацией 200 у/мл или большей можно хранить в холодильнике в течение месяца без потери активности. Перед измерением готовят рабочий раствор, содержащий 0,008 у/мл, на 0,25 н. уксусной кислоте, доведенной до рН 6,2—6,4 н. гидроокисью аммония, и разливают в четыре пробирки по 1 мл в каждой. В 1 и 3-й пробирках окисляют красную кровяную соль и едкий натр с аскорбиновой кислотой, как в опытных пробах, а во 2 и 4-й пробирках окисление осуществляют только щелочью с аскорбиновой кислотой (контроль к стандартным пробам).
Флуоресценцию измеряют на флуориметре ЭФ-3 в течение первых 30 минут после окисления проб и образования лютинов. Через 45 минут интенсивность флуоресценции понижается на 10—15%. Для дифференциации адреналина и норадреналина используют светофильтры возбуждения (первичные) и испускания (вторичные) флуоресценции. Первым набором светофильтров служат первичный фильтр ФК-1 и вторичный В2-2. Вторым набором фильтров служат первичный фильтр В2-1 и вторичные В2-2. Светофильтр ФК-1 обладает максимумом светопропускания 360 миллимикрон, В2-1— 440 миллимикрон, В2-2—570 миллимикрон. Максимум возбуждения флуоресценции для адреналина (380 миллимикрон) сдвинут в более длинноволновую часть спектра по сравнению с норадреналином (360 миллимикрон). Различия в максимумах светопропускания дают возможность отличать адреналин от норадреналина.
При первом наборе светофильтров отношение интенсивности флуоресценции эквимолярных растворов адреналина и норадреналина составляет 1,3:1,0, а при втором — 3,3:1,0. Эти различия дают возможность рассчитывать содержание адреналина и норадреналина по следующим уравнениям:
где М и Н — разность показания опыта и контроля соответственно при первом и втором наборе светофильтров, А и A1 — экстинкция 1 мг (0,001 у) стандартного раствора адреналина соответственно при первом и втором, наборе светофильтров; НА и HA1 — то же, для норадреналина, X и Y — содержание адреналина и норадреналина в 1 мл кюветы, мг. Решением двух уравнений с двумя неизвестными X и Y определяется содержание адреналина и норадреналина в 1 мл кюветы, мг. Для расчета выделения адреналина и норадреналина в 1 мл мочи указанные величины следует умножить на 5. Этот коэффициент получается из следующего уравнения:
где В — количество адреналина и норадреналина в 1 мл мочи, мг; 25 — количество мочи, взятой в анализ; 10 — общее количество уксуснокислого элюата; 4 — количество уксуснокислого элюата, взятого на нейтрализацию; 10 — объем жидкости в кювете.
У здоровых лиц средняя суточная экскреция адреналина — 8,1, а норадреналина — 22,4 микрограмма. При резко выраженном болевом синдроме они соответственно повышаются до 30 и 80—90 микрограммов. При миопатии и миастении в моче понижается уровень адреналина и в 2—3 раза повышается уровень норадреналина. При феохромоцитоме количество адреналина может повыситься до 150 микрограммов в сутки. Рентгенотерапия, введение АКТГ, кортизона, инсулина также вызывают сдвиги в выделении адреналина и норадреналина.