Определение в моче по Т. И. Иваненко и Т. С. Сахацкой.
Реактивы и оборудование: 1) хлороформ (для наркоза или химически чистый), перегнанный при температуре 61,2°; 2) метанол, дважды перегнанный при температуре 64,7°; 3) толуол, трижды промытый концентрированной серной кислотой, затем дистиллированной водой до нейтральной реакции, высушенной над перекисью фосфора и перегнанный; собирают порцию, кипящую при температуре 110°; 4) бензол («без тиофена»), перегнанный при температуре 80,2°; 5) н-гексан, перегнанный при температуре 64—68°; 6) этилацетат, промытый 1 раз 5%-ным раствором Na2CO3, затем водой до нейтральной реакции, высушенный над хлористым кальцием и перегнанный; собирают фракцию, кипящую при температуре 76—78°; 7) этанол абсолютный, без альдегидов, очищенный по методу Афиногеновой; 8) уксусный ангидрид химически чистый; 9) пиридин, свежеперегнанный при температуре 115°; 10) н-гептан химически чистый; 11) синий тетразолий; 12) гидроокись тетраметиламмония; 13) бумага хроматографическая, промытая 2 н. уксусной кислотой (3 дня), дистиллированной водой до нейтральной реакции, этанолом (3 дня) и метанолом (3 дня); промывание спиртами проводят в аппарате Сокслета;. 14) бачки для хроматографирования; 15) аппарат для вакуумной отгонки растворителей на шлифах; 16) аппарат для перегонки растворителей; 17) делительные воронки на 1000 и 2000 мл; 18) термостат; 19) спектрофотометр СФ-4; 20) ультрахимископ Брумберга (УБ-1).
24-часовую порцию мочи собирают в стеклянную посуду над небольшим количеством хлороформа. Всю порцию мочи (1/2 или 1/3 суточного количества при высоком содержании альдостерона) подкисляют концентрированной соляной кислотой до рН 1,0 и оставляют при комнатной температуре на 18—24 часа. Мочу экстрагируют 4 раза хлороформом в делительной воронке. Количество хлороформа, используемое при каждой экстракции, составляет 1/6 объема мочи. Объединенные хлороформные экстракты промывают 1 раз раствором NaOH—Na2CO3 (5%-ный раствор Na2CO3 в 0,1 н. растворе NaOH) (1/6 по объему) и затем дистиллированной водой (1/6 по объему) до нейтральной реакции промывных вод. Каждую порцию промывных вод экстрагируют небольшим количеством хлороформа, который добавляют к основному хлороформному экстракту до следующего промывания. Хлороформный экстракт мочи для высушивания фильтруют через безводный сернокислый натрий и выпаривают досуха в вакууме при температуре не выше 50°. Полученный таким образом сухой остаток очень трудно наносить на хроматограмму ввиду наличия в нем большого количества жироподобных и минеральных веществ. Распределение между 70%-ным метанолом и гексаном частично очищает содержащиеся в хлороформном экстракте стероиды от сопутствующих веществ, которые мешают последующей обработке. Сухой остаток после выпаривания хлороформа растворяют в 30 мл 70%-ного водного раствора метанола и оставляют на 30 минут.
Затем этот раствор метанола переносят в делительную воронку и осторожно промывают равным объемом гексана. Раствор метанола сливают в чистую колбочку, а гексан промывают 70%-ным метанолом (1/10 по объему), который объединяют с основным экстрактом метанола. Гексан отбрасывают, а раствор 70%-ного метанола помещают в аппарат для отгонки и метанол выпаривают при пониженном давлении. Оставшийся водный экстракт переносят в делительную воронку и экстрагируют трижды двойным объемом этилацетата. Этилацетат оставляют на ночь в холодильнике для удаления воды с растворенными в ней минеральными веществами и отгоняют в вакууме досуха. Сухой остаток растворяют в нескольких каплях 20%-ного раствора метанола в бензоле и количественно переносят на бумагу для хроматографирования.
При хроматографировании в этой системе пигменты мочи остаются на стартовой линии, а стероиды мигрируют вниз по бумаге. Подвижной фазой в системе является вода, насыщенная гептаном, а неподвижной фазой — гептан, для получения подвижной фазы воду и гептан смешивают в отношении 10: 1, взбалтывают и оставляют на ночь при комнатной температуре. Для насыщения хроматографического бачка парами растворителя подвижную фазу наливают на дно бачка, а неподвижную—в бюксу. Отношение количества подвижной фазы в бачке к неподвижной должно составлять 10:3. В каждую из фаз опущена фильтровальная бумага, прижатая к стенкам бачка. После того как фильтровальная бумага смочится растворителями, в лодочку помещают хроматографическую бумагу с нанесенной в виде полоски пробой. Через 2 часа в лодочку вносят подвижную фазу. Процесс прохождения растворителя занимает 4— 5 часов. По окончании хроматографирования хроматограмму вынимают из бачка, сушат и просматривают в ультрафиолетовом свете на ультрахимископе Брумберга.
Хроматографирование в системе гептан — вода в значительной степени освобождает экстракты мочи от пигментов и флуоресцирующих веществ, мешающих обнаружению стероидов при просмотре хроматограмм в ультрафиолетовом свете. Участок хроматограммы, поглощающий ультрафиолетовый свет, вырезают и элюируют метанолом. На этой хроматограмме приходится вырезать и элюировать довольно большой участок бумаги, который измельчают и помещают в колбу. В колбу наливают метанол в таком количестве, чтобы покрыть нарезанные кусочки бумаги, и помещают в шуттль-аппарат на один час. Элюцию повторяют трижды со свежими порциями метанола.
Элюаты метанола фильтруют через фильтр Шотта для освобождения от волокон бумаги, объединяют и выпаривают под вакуумом досуха. Сухой остаток элюата с первой хроматограммы количественно переносят 20%-ным раствором метанола в бензоле в одну точку на хроматографической бумаге. На тот же лист бумаги наносят свидетель — альдостерон, а при отсутствии последнего — кортизон и гидрокортизон (по 10—20 y)- Хроматографирование проводят в системе бензол—метанол—вода в отношении 100 :55:45 (система В-5 Буша) при температуре 36—38°.
В этой системе альдостерон располагается несколько выше кортизона, но ниже гидрокортизона. Хроматографированием в этой системе достигается отделение альдостерона от гидрокортизона. Для элюции вырезают участок хроматограммы от нижнего края пятна, соответствующего гидрокортизону, и на 1 см ниже пятна, соответствующего кортизону.
Элюат этой зоны наносят на бумагу, как указано выше. В качестве свидетеля используют гидрокортизон и хроматографирование проводят в системе толуол — этилацетат — метанол — вода в отношении 90 : 10 : 55 : 45 (система С. Буша). В этой системе альдостерон располагается на уровне гидрокортизона. С помощью хроматографирования в этой системе удается полностью отделить альдостерон от кортизона. Зону, соответствующую альдостерону, элюируют метанолом, упаривают досуха и сухой остаток ацетилируют.
К сухому остатку после третьего хроматографирования приливают 0,15 мл уксусного ангидрида и 0,3 мл пиридина. Смесь оставляют на ночь при комнатной температуре. То же проделывают в параллельной пробирке со стандартом альдостерона или моноацетата альдостерона. Ацетилирующую смесь удаляют струей углекислоты или азота. При отсутствии стандарта свободного альдостерона или моноацетата альдостерона ацетилированию подвергают кортикостерон. Сухой остаток ацетилированных стероидов наносят на бумагу для следующего хроматографирования, которое проводят в системе гексан — бензол — метанол — вода в отношении 667 : 333 : 800 : 200 (система В-3 Буша). При хроматографирования в этой системе кортикостерон-ацетат располагается несколько выше диацетата альдостерона.
При хроматографирования ацетилированной альдостероновой фракции мочи происходит отделение 2—3 веществ, поглощающих ультрафиолет, и 2—3 веществ, дающих окраску с синим тетразолием.