Циммермановская реакция: к сухому остатку, полученному после упаривания экстракта, прибавляют чистой пипеткой последовательно (если кювета емкостью 6 мл) по 2 мл 96-градусного этилового спирта и 2%-ного спиртового раствора метадинитробензола, приготовленного перед употреблением. Смесь нагревают в водяной бане при температуре 60° в течение 3 минут. По охлаждении до температуры 28—30° к смеси прибавляют 2 мл 3 и. раствора едкого калия, содержимое пробирки хорошо взбалтывают и, не закрывая ее, выдерживают в водяной или воздушной бане при температуре 28° в течение 45 минут (без доступа прямого света). Для получения лучшей интенсивности окраски раствора используют термостат. С испытуемым раствором ставят и слепой опыт, контрольный, только с одними реактивами, употребляемыми для испытуемого раствора. Если температура окружающего воздуха во время колориметрирования очень низка, то в окрашенных растворах могут выпасть кристаллы метадинитробензола, которые делают невозможным колориметрирование. Это явление можно предотвратить (после 45-минутного выдерживания растворов при температуре 28°), оставляя окрашенные растворы в водяной или воздушной бане при температуре 18—20° до окончания колориметрирования.
Колориметрирование окрашенных растворов можно проводить в электроколориметрах различных систем, снабженных зелеными светофильтрами, поглощающими длины волн около 520—530 миллимикрон. Чаще всего для этой цели используют фотоэлектроколориметр ФЭК-М. Соотношение между отсчетами по шкале фотоэлектроколориметра и содержанием нейтральных 17-кетостероидов в данной пробе устанавливается по калибрационной кривой. Последняя вычерчивается на основании результатов, полученных при калибровке колориметра по кристаллическому андростерону.
Для этого 10 мг кристаллического андростерона (температура плавления 183—184°) помещают в мерную колбу емкостью 100 мл, растворяют в 100 мл абсолютного этилового спирта. Для лучшего растворения андростерона спирт прибавляют в колбу по 15—20 мл, каждый раз хорошо взбалтывая его; доведя раствор до метки, колбу с раствором плотно закрывают притертой пробкой и оставляют при комнатной температуре в темном месте не менее чем на сутки до взятия проб. В 1 мл этого раствора содержится 100 у андростерона. Из полученного раствора отбирают серию проб с концентрацией от 5 до 500 микрограммов в следующей последовательности: 5, 10, 20, 25, 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500 андростерона. Спиртовой раствор упаривают в водяной бане досуха. Дальнейшая обработка стандартных проб ведется аналогично пробам, содержащим гормоны мочи, т. е. проводится обычная циммермановская реакция и на основании показаний оптической плотности стандартных проб вычерчивается калибрационная кривая.
Расчет. Количество нейтральных 17-кетостероидов рассчитывается по следующей формуле:
где х — количество нейтральных 17-кетостероидов в миллиграммах в сутки; А — общее количество эфирного экстракта, мл; В — количество микрограммов гормонов, найденное по калибрационной кривой; Д — диурез, мл; К — количество эфирного экстракта, взятого для колориметрирования, мл; М — количество мочи, отобранное для анализа, мл.
В норме нейтральных 17-кетостероидов за сутки с мочой выделяется у здоровых мужчин от 9 до 22 мг; у женщин от 7 до 18 мг; у детей до 3 лет до 0,5 мг; в возрасте 3—8 лет до 2,5 мг; 8—12 лет до 5—6 мг. У мальчиков к 14 годам экскреция 17-кетостероидов достигает 10 мг, к 16—18 годам — 18 мг; у девочек к 14 годам — 8,5 мг; в 16—18 лет — 14 мг.