Определение по О. М. Уваровской

Определение по О. М. Уваровской. Реактивы: концентрированная серная кислота. Сернокислый аммоний. Эфир для наркоза. Нормальный раствор едкого калия или натрия. 3 н. раствор едкого калия. 96-градусный этиловый спирт. Абсолютный этиловый спирт (выдержанный над медным купоросом и перемешанный). 2%-ный спиртовой раствор метадинитробензола (дважды или трижды перекристаллизованный в этиловом спирте). Раствор готовится перед употреблением. Кристаллический андростерон.

Мочу собирают в чистую сухую банку в течение 24 часов начиная с 6—8 часов утра и до 6—8 часов следующего утра, причем первая ночная порция (сразу же после пробуждения) выбрасывается и с этого момента отмечается час начала сбора мочи. Мочу собирают за сутки.

Суточную мочу тщательно перемешивают стеклянной палочкой и, измерив объем, отбирают пробу (с параллельными) в количестве 25 мл в эрленмейеровскую колбочку емкостью 50 мл. Взятую пробу подкисляют 1,5—2,0 мл концентрированной серной кислоты до кислой реакции по конго (красная реактивная бумажка синеет) и нагревают в кипящей водяной бане в течение 30 минут.

После нагревания вынимают колбу из бани, к гидролизату мочи быстро прибавляют 13 г сернокислого аммония. Смесь хорошо взбалтывают до полного растворения соли. Если соль не растворилась, смесь нагревают на водяной бане при температуре 70—80° при непрерывном взбалтывании до полного растворения. Далее колбу с содержимым оставляют при комнатной температуре до следующего дня. Выпавший осадок отделяют фильтрованием через бумажный складчатый фильтр без отсасывания. По окончании фильтрования фильтрат выбрасывают, а фильтр с осадком и колбочку с несмывшимся осадком оставляют при комнатной температуре на 1—3 часа или до следующего дня (можно оставить на 30 минут).

Фильтр с осадком снимают с воронки и помещают на дно той же колбы, в которой происходил гидролиз (необходимо расправить фильтр равномерно стеклянной палочкой по дну колбы). В колбочку с фильтром приливают 2 раза по 7 мл 1 н. едкого калия или натра, и этой щелочью хорошо смывают осадок с фильтра и стенок колбы, после чего раствор щелочи выливают в делительную воронку на 0,1 л. Затем в ту же колбочку дважды наливают по 7 мл эфира для наркоза, снова взбалтывают для растворения осадка и выливают в ту же делительную воронку. Содержимое делительной воронки взбалтывают круговыми движениями в течение 2—3 минут. После 30-минутного стояния водно-щелочной раствор отделяют от эфирного экстракта.

Для полного растворения осадка на фильтре, а также лучшей очистки нейтральных 17-кетостероидов от эстрогенных гормонов и других фенольно-хромогенных веществ фильтр с оставшимся осадком и эфирный экстракт вновь обрабатывают 2—3 раза 1 н. раствором щелочи, каждый раз употребляя по 8—10 мл. Водно-щелочной раствор содержит эстрогенные гормоны. Эфирный экстракт, содержащий нейтральные 17-кетостероиды, промывают последовательно один раз 10—12 мл 0,1 н. раствором серной кислоты и один раз таким же количеством дистиллированной воды. При этом содержимое воронки слегка взбалтывают круговым движением 1—2 раза и медленно отделяют промывной раствор от эфирного слоя. Водный раствор выбрасывают. Эфирный экстракт, тщательно отделенный от капель воды, переносят в чистую сухую пробирку и измеряют его количество. Пробирку можно закрыть корковой пробкой и оставить при комнатной температуре в темном месте до следующего этапа работы.

Точно измерив объем эфирного экстракта (после параллельных проб измерительный цилиндр ополаскивают чистым эфиром), отбирают чистой градуированной пипеткой пробу в сухую, чистую пробирку. Количество эфирного экстракта берут в зависимости от емкости кювет, применяемых для колориметрирования, количества суточной мочи и предполагаемого количества гормонов в данной пробе. Для кювет емкостью G мл эфирного экстракта может быть взято от 0,5 до 2 мл. При кюветах большей или меньшей емкости количество экстракта соответственно увеличивается или уменьшается.

Взятую для колориметрирования пробу эфирного экстракта упаривают в водяной бане досуха; сначала при температуре 36—38°, а затем постепенно последнюю увеличивают до 50—60°. Для полного удаления влаги пробирку с сухим остатком выдерживают в эксикаторе над хлористым кальцием 1—3 часа (не менее 30 минут).