Хроматографическое фракционирование нейтральных 17-кетостероидов мочи (видоизменение метода Дингеманса). Реактивы. Ледяная уксусная кислота. Концентрированная соляная кислота. Бензол (для криоскопии, без тиофена, перегнанный). Н. едкий натр. Сернокислый безводный натрий. Окись алюминия (Al2O3) безводная. Абсолютный этанол. Едкий калий, насыщенный (в день опыта разводится абсолютным спиртом 1 : 4 и центрифугируется). Метадинитробензол перекристаллизованный (в день опыта готовится 1,16% на абсолютном спирте). Кристаллический дегидроизоандростерон или андростерон для приготовления стандартного раствора.
150 мл мочи подкисляют уксусной кислотой до кислой реакции по лакмусу и экстрагируют 50 мл бензола в колбе с обратным холодильником на водяной бане в течение 1 часа. Охладить, перенести в делительную воронку на 0,5 л, встряхивать 3 минуты, дать отстояться и отделить бензол. Мочу помещают снова в колбу, прибавляют 15 мл соляной кислоты и 50 мл бензола и экстрагируют в кипящей водяной бане 2 часа. Бензол отделяют, и экстракцию повторяют еще один раз с 50 мл бензола.
Все три бензольных экстракта сливают вместе, промывают их 3 раза 15 мл едкого натра, 2 раза водой, высушивают минимальным количеством безводного сернокислого натрия (3—4 г). Экстракт количественно переносят в колбу Вюрца и выпаривают под вакуумом.
Хроматографическую колонку шириной 5—6 мм в нижней части плотно закрывают ватой, предварительно промытой спиртом. Готовят суспензию из 2 г окиси алюминия и 5 мл бензола, которая переносится в колонку (не допускать образования пузырьков воздуха) и уплотняется под давлением воздуха из футбольной камеры. Сухой остаток бензольного экстракта растворяют в 10 мл бензола, 2 мл которого осторожно переносят в колонку (без взмучивания окиси алюминия). Затем адсорбированные стероиды элюируют смесью бензола и этанола по следующей схеме:
Бензол............. 6 раз по 5 млБензол + 0,1 об. % абсолютного спирта ... 20 раз по 5 мл
Бензол + 0,5 об. % абсолютного спирта ... 10 раз по 5 мл
Бензол + 2 об. % абсолютного спирта . . 4 раза по 5 мл
Жидкость пропускается через колонку со скоростью 1 капля в 4—5 секунд. Полученные элюаты выпариваются досуха. К сухим остаткам элюатов прибавляются: метадинитробензола 0,2 мл и едкого калия 0,2 мл. Оставляют в термостате при 25° на 45 минут, затем добавляют по 2 мл 70%-ного этанола и колориметрируют в ФЭКе при зеленом светофильтре (520 миллимикрон) в кювете шириной 5 мм. Расчет но кривой, полученной с кристаллическим дегидроизоандростероном, производят по формуле
где Д — суточный диурез; 2 — количество экстракта, взятое для хроматографии, мл; 10—общее количество экстракта; 150 — количество мочи, взятое для экстрагирования; 1000 — пересчет, мг.
Если на оси абсцисс отложить номера элюатов, а на оси ординат — величины содержания в них 17-кетостероидов, получают кривую с семью пиками. Каждый из них соответствует определенной группе стероидов, а именно:
| № элюатов | Группа | Названия 17-кетостероидов |
| 1—4 5—8 9—16 17—26 27—32 33—36 37—40 |
I II III IV V VI VII |
Δ 2-андростен, 3-Cl-5-андростен, Δ 3,5-андростадиен 1-андростан-6-ол дегидроизоандростерон, изоандростерон андростерон, Δ-9-андростен-Зα-ол этиохолан-3 α-ол, Д-9-этиохолен-З-ол п-окси-гидрэксиандростерон, п-окси-гндроксиэтиохолан не идентифицированные |
При кислотном гидролизе происходит частичная дегидратация некоторых 17-кетостероидов, что ведет к переходу этих стероидов в другие фракции и, следовательно, к нарушению хроматограммы. Поэтому гидролиз надо производить одновременно с экстракцией. Количество окиси алюминия в колонке должно превышать количество адсорбируемых 17-кетостероидов в 2500 раз. В соответствии с этим количество вносимых в колонку 17-кетостероидов при 2 г Al2O3 не должно превышать 0,7—0,8 мг (24 мг в 1 л мочи).
Пики дегидроизоандростерона и андростерона проверяются на кристаллических препаратах этих веществ.