Люминесцентный анализ

Люминесцентный анализ — совокупность методов анализа, основанных на наблюдении люминесценции. Для возбуждения люминесценции (см.) исследуемый объект подвергается действию ультрафиолетового света (ртутно-кварцевая лампа). Наблюдение свечения производится в темном помещении визуально или при помощи специальных приборов (флюорометров).

Качественный люминесцентный анализ основан на различии цвета люминесценции, производимой веществами разной химической природы; количественный люминесцентный анализ — на измерении интенсивности люминесценции при помощи флюорометров или путем регистрации спектров люминесценции специальными спектрографами. Люминесцентный анализ широко применяется для определения витаминов, гормонов, антибиотиков, канцерогенных веществ, лекарственных веществ и др. в различных материалах, в том числе и биологических объектах (кровь, моча, ткани и др.).

Люминесцентный анализ в гигиене. В санитарно-гигиенической практике люминесцентный анализ получил распространение при оценке качества пищевых продуктов (наличие посторонних примесей, порча продуктов). В зависимости от свежести мяса, рыбы и других пищевых продуктов возникают разные оттенки и интенсивности люминесцентного свечения. Для анализа можно использовать водные вытяжки из продуктов (измельченную навеску смешивают с диет, водой в отношении 1 : 10 и встряхивают). Вытяжки помещают в флюорометр, который позволяет измерить интенсивность люминесценции. Например, интенсивность люминесценции экстракта из свежего мяса (парного или охлажденного) настолько мала, что не поддается измерению в приборе. В экстрактах мяса, условно годного, интенсивность люминесценции значительно выше и колеблется в пределах 18—30 условных единиц. Показания прибора сверх 30 характеризуют мясо как несвежее. При определении свежести рыбы и рыбных продуктов количественные методы люминесцентного анализа позволяют фиксировать начальную стадию порчи продукта.



Предложен люминесцентный метод определения белков в молоке, при помощи которого без затрат реактивов можно произвести анализ за 3—5 мин. (вместо 8—12 часов по методу Кьельдаля). Метод основан на измерении интегральной интенсивности свечения триптофана белков молока, разведенного в десять раз водой, при возбуждении ультрафиолетовым светом (длина волны 250— 290 ммк). Для определения качества воды также можно использовать люминесцентный анализ. Люминесцентное свечение вод обусловлено содержащимися в них органическими веществами, а также обитающими в воде организмами, клетками водорослей и остатками водных растений. Для чистых вод водопроводов и артезианских скважин характерна слабо-фиолетовая люминесценция. Вода московского и ленинградского водопроводов люминесцирует очень слабо; дистиллированная вода практически не светится. Образцы вод с голубоватым и синеватым оттенком свечения характерны для вод с различной степенью загрязнения. Воды с высокой цветностью светятся желто-зеленым цветом. Сточные воды пищевой промышленности отличаются ярким (голубым, лиловым, синим, красноватым) свечением. Свечение гуминовых соединений маскирует люминесценцию органических соединений, попавших в воду вместе с загрязнением.

Количественный люминесцентный анализ основан на зависимости, существующей между интенсивностью люминесценции и концентрацией люминесцирующего вещества. При малых концентрациях вещества в растворе интенсивность люминесценции пропорциональна его содержанию. При больших концентрациях люминесцирующего вещества эта пропорциональность нарушается. Техника количественного люминесцентного анализа состоит в эмпирическом определении отношения между концентрацией исследуемого вещества и интенсивностью люминесцентного свечения. Предварительно устанавливают такую же зависимость для серии стандартных растворов с заранее известным количеством определяемого вещества. По данным, полученным при измерении серии стандартных растворов, строят калибровочный график, в соответствии с которым по интенсивности люминесцентного излучения анализируемого раствора определяют в нем концентрацию вещества. В ряде методик количественного люминесцентного анализа пользуются не заранее составленным калибровочным графиком, а определяемой в ходе анализа интенсивностью люминесценции стандартного раствора.

Люминесцентный анализ может быть использован для определения канцерогенных веществ, урана в различных объектах внешней среды, инсектицидов и нефтепродуктов в воде открытых водоемов и др. См. также Люминесцентная микроскопия.



Люминесцентный анализ — совокупность методов анализа, основанных на явлении люминесценции (см.).

Достоинством методов люминесцентного анализа является очень высокая чувствительность. Так, краситель флюоресцеин может быть обнаружен по его свечению при концентрации в растворе около 10-8 моль/л, а по поглощению света на спектрофотометре — лишь в концентрациях 10-5—10-6 моль/л. В широком диапазоне концентраций, не превышающих максимальной, при которой абсорбция (поглощение) раствором возбуждающего света, а также реабсорбция люминесцентного свечения становятся значительными, интенсивность люминесценции вещества пропорциональна его концентрации. Поэтому, измерив интенсивность люминесценции раствора с известной концентрацией вещества, можно затем легко определять концентрации этого вещества в исследуемых растворах. Преимущества методов люминесцентного анализа сказываются еще ощутимее при работе с многокомпонентными средами, если при этом флюоресцирует лишь определяемое вещество или хотя бы имеется область спектра (ее можно выделить при помощи оптических фильтров), в которой оно преимущественно флюоресцирует. С этой целью применяют фотоэлектрические флюориметры.

Для возбуждения люминесценции веществ, поглощающих в ультрафиолетовой части спектра, применяют ртутно-кварцевые, водородные и дейтериевые лампы, испускающие значительную часть световой мощности в этом участке спектра. Для возбуждения веществ, поглощающих видимые волны, применяют оптические лампы накаливания с малогабаритными, «точечными» спиралями. Выделение из полного светового потока излучения заданного спектрального участка, хорошо поглощаемого исследуемым соединением (и мало поглощаемого прочими люминесцирующими веществами, если они имеются), достигается применением различных оптических фильтров. Наиболее селективны интерференционные фильтры, которые могут пропускать полосу шириной всего в 10 ммк. Неизвестные соединения определяют путем снятия спектров люминесценции при помощи спектрофлюориметров.

Значительное число неокрашенных органических соединений, характеризующихся поглощением в ультрафиолетовой части спектра (например, белки, аминокислоты, нуклеиновые кислоты, углеводы и их метаболиты), дают широкую, малоспецифическую полосу люминесценции в диапазоне близких (ультрафиолетовых, фиолетовых и синих) длин волн; их идентификация по спектрам люминесценции зачастую затруднительна. В этих случаях исследуемый материал замораживают до —100а (иногда замораживание можно заменить суспендированием в масле); при этом спектры люминесценции сужаются и обнаруживают специфическую тонкую структуру.

Спектры люминесценции чувствительно реагируют порой на незначительные изменения состояния вещества (агрегация, изменение окислительно-восстановительного потенциала, изменения молекул, связанные с изменением рН, изменения во вторичной структуре и др.). При этом меняются и другие характеристики соединений. Так, при агрегации хлорофилла происходит смещение его люминесцентного свечения в сторону длинных волн, а выход люминесценции и ее длительность падают в несколько раз. Пиридиннуклеотид при переходе из восстановленного состояния в окисленное вообще перестает люминесцировать. Флюоресценция флавинов сильно зависит от рН среды и т. д.

Кроме прямых методов люминесцентного анализа, существует ряд косвенных. Например, в норме не флюоресцирующая кровь приобретает это свойство при добавлении к ней серной кислоты. Кислород известен как эффективный тушитель люминесценции многих соединений; это явление используется как индикатор на содержание кислорода.

Разрабатываются и специальные методы люминесцентного анализа. Например, из насекомых светляков выделяют фермент люциферазу, которая может в присутствии аденозинтрифосфата окислять люциферин с испусканием хемилюминесцентного свечения. Интенсивность последнего при взятой в избытке люциферин-люциферазной системе пропорциональна концентрации аденозинтрифосфата в исследуемой суспензии. При прокрашивании нуклеиновых кислот красителями профлавинового ряда флюоресцентные характеристики последних сильно меняются при изменениях в структуре биополимера. Методы люминесцентного анализа в последнее время применяют при исследовании соединений, относящихся к классам пуринов, порфиринов (особенно хлорофиллы), витаминов, стероидных гормонов, аминокислот, белков, а также различных лекарств. Кроме того, люминесцентный анализ используют в люминесцентной бумажной хроматографии, при флюорохромировании, титровании и в люминесцентной микроскопии (см.).