Микроскопия — это зрительное исследование различных мелких объектов (от 0,2 до 0,0000002 мм) при помощи микроскопа (с увеличением от нескольких десятков до сотен тысяч раз).
Обычный световой микроскоп (см.) используется в тех случаях, когда структуры объекта достаточно контрастны и хорошо различимы. Световая микроскопия позволяет получить увеличенное и подвижное изображение, провести микрофото- и киносъемку, длительно наблюдать один и тот же объект. В тех случаях, когда объекты микроскопии недостаточно контрастны, для их изучения применяют специальные методы световой микроскопии.
1. Микроскопия в темном поле (и ее разновидность — ультрамикроскопия) основана на том, что мельчайшие частицы, лежащие за пределами разрешающей способности микроскопа, становятся видимыми в лучах, идущих под таким большим углом, что в объектив они непосредственно не попадают (мощный пучок бокового света). В объектив попадает только свет, отраженный от этих частиц;
при этом они выглядят светящимися точками на темном фоне.
2. Фазово-контрастная микроскопия позволяет резко повысить контрастность изображения объекта. Принцип метода состоит в выявлении сдвигов фазы световых колебаний, которые возникают, когда свет проходит сквозь структуру, имеющую показатель преломления, отличающийся от показателя преломления окружающей среды. Фазовые сдвиги глазом непосредственно не улавливаются, но в специальном фазово-контрастном микроскопе структуры, имеющие более высокий показатель преломления (даже совершенно прозрачные), оказываются более темными (или более светлыми в зависимости от конструкции прибора), чем окружающий фон.
Подобного рода картина наблюдается и при так называемой амплитудно-контрастной или аноптральной микроскопии.
3. Ультрафиолетовая микроскопия, основанная на способности некоторых веществ избирательно поглощать ультрафиолетовые лучи с определенной длиной волны, принципиально почти ничем не отличается от обычной световой микроскопии и осуществляется при помощи микроскопов с кварцевой или отражательной (зеркальной) оптикой. Изображение рассматривается на флюоресцирующем экране визуально, а также фотографируется. Микроскопирование объектов позволяет выявить исследуемые вещества, не применяя окрашивания.
4. Флюоресцентная (люминесцентная) микроскопия позволяет изучать как собственную (первичную) флюоресценцию ряда веществ, так и вторичную флюоресценцию, вызванную окрашиванием клеточных структур специальными красителями — флюорохромами. Принцип метода состоит в том, что некоторые вещества при световом облучении начинают светиться сами. Для возбуждения флюоресценции в видимой части спектра обычно пользуются синим светом или ультрафиолетовыми лучами.
Многие вещества, не флюоресцирующие в видимой области (в особенности нуклеиновые кислоты), при освещении ультрафиолетовыми лучами начинают флюоресцировать и могут выявляться без применения флюорохромов. К вторичной флюоресценции относится иммунофлюоресценция, основанная на взаимодействии иммунного белка с флюорохромами. См. также Микроскоп, Микроскопическая техника.
Микроскопия (от греч. mikros — малый и skopeo — рассматриваю, исследую) — это метод зрительного исследования мелких объектов при увеличениях от нескольких десятков до сотен тысяч раз. Для современной микроскопии доступны практически все тела размерами от 0,2 до 0,0000002 мм. Различают световую и электронную микроскопию. Световая микроскопия обеспечивает полезное увеличение до 2—3 тыс. раз, цветное и подвижное изображение живого объекта — возможность микрокиносъемки и длительного наблюдения одного и того же объекта, оценку его динамики и химизма. Она незаменима в диагностических и исследовательских работах, повседневно необходима в практической медицине.
Электронная микроскопия (см.) позволяет работать при увеличениях до многих сотен тысяч раз, но только с высушенными, убитыми или нежизнедеятельными объектами. Ее научное значение исключительно велико, применение же в практических, в том числе диагностических, целях возможно, но пока не разработано. Общим как у световой, так и электронной микроскопии остается описание форм по увеличенному изображению объекта и сопоставление форм с различными функциональными, химическими и иными свойствами.
Разрешающая способность и контраст — основные характеристики любого микроскопа. Разрешающая способность количественно выражается минимальным расстоянием, на котором находятся две точки, демонстрируемые микроскопом раздельно (минимальное разрешаемое расстояние, или разрешение). Разрешение человеческого глаза в режиме наилучшего видения равно 0,2 мм. Изображения двух точек, расположенных одна к другой ближе 0,2 мм, сливаются, и невооруженный глаз обнаруживает вместо двух точек какую-то иную фигуру (изображение геометрически не соответствует реальному объекту). Такая же ошибка возникает в любом оптическом приборе, строящем неразрешенное изображение. Увидеть неразрешенный объект можно только при условии, что он светится значительно ярче, чем фон (типичный пример неразрешенного изображения — звезды на ночном небе). Такой объект независимо от его реальной формы выглядит как яркая точка. Для неразрешенного объекта любое увеличение является бесполезным, так как ни при каких условиях его реальная форма и детали не могут быть изображены и рассмотрены. Разрешение светового микроскопа достигает 0,0002 мм. Следовательно, при его помощи можно достичь полезного увеличения в 1000—2000 раз. Наиболее опытные микроскописты, применяя лучшие средства повышения контраста, получают хорошие микрофотографии при увеличениях порядка 3000— 4000 раз. Этим и исчерпываются возможности полезного увеличения светового микроскопа.
Контраст изображения определяется различием яркостей фона и изображения. Если яркости различаются менее чем на 3—4%, их различие не может быть уловлено ни глазом, ни фотопластинкой; изображение останется невидимым, даже если микроскоп разрешает его детали. Контраст зависит как от свойств объекта, изменяющих световой поток по сравнению с фоном, так и от способности оптики уловить возникающие различия в свойствах луча.
Естественные пределы возможностей светового микроскопа обусловлены волновой природой света. Конструкции современных микроскопов отработаны настолько хорошо, что верхние пределы их технических возможностей почти совпадают с этими естественными, физическими границами. Существуют, однако, весьма многочисленные факторы, которые ухудшают режим работы микроскопа и снижают научно-практическую ценность получаемых результатов. Большинство из этих факторов контролируется знаниями и умением микроскописта. Соблюдение правил микроскопической техники (см.) обязательно для квалифицированной работы, т. е. для приближения реальных результатов микроскопирования к расчетным возможностям данного прибора.