Хроматография — это метод разделения смесей на составляющие их вещества, основанный на различиях в степени поглощаемости отдельных веществ при прохождении их через слой поглотителя.
Хроматография используется для качественного и количественного определения веществ в различного рода смесях, в диагностических целях (например, изменения содержания отдельных аминокислот в плазме крови, в тканях печени и других органов, наступающие при целом ряде патологических состояний, и т. д., и т. п.), а также для препаративных целей при получении многих, в том числе и биологически активных, веществ.
В клинических, санитарно-гигиенических и фармацевтических лабораториях широко применяются следующие виды хроматографии.
Рис. 1 Колоночная хроматография: 1— исследуемый раствор; 2 — слой сорбента; 3 — зоны, образуемые веществами, входящими в состав анализируемой смеси.
Рис. 2. Хроматография на бумаге: 1 — бумажная полоска; 2 — окрашенные пятна, соответствующие разным веществам, входившим в состав анализируемого раствора; 3 — капля анализируемого раствора; 4 — линия старта; 5 — растворитель.
Колоночная хроматография — осуществляется пропусканием исследуемого раствора, содержащего несколько растворенных веществ, через стеклянную трубку (колонку — рис. 1), заполненную порошкообразным поглотителем (сорбентом). Вследствие неодинаковой поглощаемости (сорбируемости) различных веществ происходит их разделение. Чем лучше поглощается вещество, тем в более высоких частях колонки оно задерживается. Определение природы вещества производят или по собственной характерной окраске вещества, или пропусканием через колонку (после разделения смеси) раствора реагента - проявителя, образующего с анализируемыми веществами специфически окрашенные соединения. Полученный таким образом слой сорбента с различно окрашенными зонами называют хроматограммой. Вещества, сорбированные на колонке, могут быть последовательно вытеснены (вымыты) и собраны по фракциям. Этот процесс называют элюцией.
Бумажная хроматография — проводится на полосках специальных сортов бумаги. Капля исследуемого раствора наносится на некотором расстоянии от края бумажной полоски (рис. 2). Край полоски помещают в соответствующий растворитель, который перемещается по капиллярам бумаги вдоль полоски. При этом происходит разделение веществ: чем хуже поглощается вещество, тем дальше будет находиться оно от линии старта. По окончании разделения полоску высушивают и опрыскивают раствором реагента, образующего с определяемыми веществами характерно окрашенные соединения.
Хроматография в тонком слое сорбента аналогична хроматографии на бумаге. Различие состоит в том, что в этом случае на стеклянную пластинку наносят тонкий слой порошкообразного сорбента (например, окись алюминия, силикагель, каолин, ионообменная смола). Техника разделения анализируемой смеси на отдельные вещества и методы качественного их определения в основном те же, что и при хроматографии на бумаге.
В последние годы в клиническую и лабораторную практику все шире стали проникать так называемые автоматические анализаторы — приборы, позволяющие произвести хроматографический анализ с помощью автоматических устройств с одновременной записью полученных результатов на специальную ленту.
Хроматография (от греч. chroma, chromatos — цвет, окраска и grapho — записываю; буквально — цветопись) — сорбционный динамический метод разделения смесей веществ. Предложен М. С. Цветом в 1903 г. для анализа пигментов растений. Впоследствии стал универсальным методом разделения смесей окрашенных и бесцветных веществ любой природы в аналитических и препаративных целях.
Метод заключается в поглощении исходной смеси небольшим участком слоя зерненого сорбента, помещенного в колонку, и в последующем раздвижении зон компонентов (элюции) при пропускании через слой сорбента элюэнта — растворителя или раствора, не содержащего компонентов анализируемой смеси. При элюции компоненты смеси перемещаются по слою сорбента с различной скоростью и вследствие этого разобщаются на сорбенте в виде изолированных зон, а при дальнейшем элюировании сорбента последовательно переходят в фильтрат (рис. 1). Хроматография позволяет получать чистые вещества, в том числе биологически активные (морфин, антибиотики, витамины, гормоны, ферменты и др.). Вместо колонок сорбента часто используют нанесенный на стеклянную пластинку тонкий порошок (силикагель, глина, Al2O3, MgO и др.) — это тонкослойная хроматография (ТСХ) или полосы фильтровальной бумаги (хроматография на бумаге). В этом случае компоненты смеси образуют изолированные пятна; отношение скоростей их перемещения к скорости перемещения фронта растворителя (величина Rf) характеризует природу вещества, площадь — его количество. Эти методы позволяют разделять и анализировать 10—8 — 10—6 г вещества. В аналитическом аспекте хроматография позволяет идентифицировать вещество на основании сопоставления скоростей перемещения его и «свидетеля» по слою сорбента и облегчает количественный анализ смесей, близких по свойствам компонентов.
Рис. 1. Последовательные стадии процесса хроматографического разделения смеси веществ (а, b, с и d): I — первичная хроматограмма; II—III — последовательные стадии элюирования; внизу— выходные кривые веществ (a, b и c).
Различают хроматографию адсорбционную, ионообменную, распределительную и осадочную; в последнее время к хроматографическим методам относят метод гелевой фильтрации.
Адсорбционная хроматография (АХ). В основе АХ лежит процесс адсорбции (см.) компонентов смеси сорбентом. В АХ используют пористые сорбенты с большой удельной поверхностью (100—1000 м2/г). АХ широко применяют для получения лекарственных веществ, анализа биологических материалов и др.
Ионообменная хроматография (ИОХ). Основана на поглощении ионов сорбентом в результате гетерогенной химической реакции ионного обмена между сорбентом и анализируемым раствором. В ИОХ используют природные и синтетические ионообменные вещества (см. Иониты), поглощение которыми компонентов смеси возрастает с увеличением заряда иона компонента, а для ионов равной величины заряда — с увеличением радиуса иона. ИОХ — наиболее совершенный метод качественного и количественного анализа аминокислот и пептидов. Использование автоматического анализатора, в основу работы которого положен метод фракционирования аминокислот на сульфокатионитах по Муру, Спеккману, Стайну, позволяет анализировать до 60 азотсодержащих соединений (рис. 2); полный анализ, для которого достаточно 0,01—0,025 мкмоля каждой аминокислоты, осуществляется за 3—5 час.
Рис. 2. Хроматограмма свободных аминокислот депротеинизированной плазмы крови здорового человека (1,7 мл); колонка размером 69Х0,9 см; разделение нейтральных и кислых аминокислот.
Для разделения смесей высокомолекулярных соединений (белки, нуклеиновые кислоты, кислые полисахариды и пр.) используют ионообменные сефадексы (СИ) или несшитые линейные иониты на основе целлюлозы (ЦИ). СИ получают введением остатков кислоты или основания в готовый сополимер; получены два катионита—карбоксиметил (KMC) и сульфоэтилсефадекс (СЭС) и анионит—диэтиламиноэтилсефадекс (ДЭАЭ-С). ЦИ представляют эфиры целлюлозы с различными ионогенными группами; широко применяют катиониты — карбоксиметилцеллюлоза, фосфатцеллюлоза, сульфоэтилцеллюлоза; аниониты — диэтиламиноэтилцеллюлоза (ДЭАЭ-Ц, почти универсальный анионит), триэтиламиноэтилцеллюлоза (ТЭАЭ-Ц), слабоосновной анионит — ЭКТЕола-целлюлоза (ЭКТЕола-Ц), полученная реакцией целлюлозы с эпихлоргидрином и триэтаноламином. Обменная емкость СИ больше, чем ЦИ, и составляет 3—4,5 мг-экв/г.
При помощи ЦИ или СИ достигнуты большие успехи в области выделения и очистки белков, в том числе ферментов, гормонов, токсинов, нуклеиновых кислот, крупных бактериальных полисахаридов. ДЭАЭ-Ц или ЭКТЕола-Ц, нанесенные тонким слоем на пластины,— лучшие сорбенты для быстрого и очень тонкого фракционирования нуклеотидов и нуклеиновых кислот.
Распределительная хроматография (РХ). Разделение компонентов смесей при этой хроматографии обусловлено различиями в их коэффициентах распределения между неподвижной фазой, удерживаемой инертным сорбентом, и подвижной фазой — растворителем или газом; в последнем случае говорят о газораспределительной хроматографии (ГРХ). РХ — наиболее распространенный аналитический и препаративный метод фракционирования близких по строению веществ. В качестве инертного носителя используют преимущественно полярные вещества — целлюлозу (в виде листов фильтровальной бумаги), реже — силикагель. Техника хроматографии на бумаге очень проста; в зависимости от направления движения растворителя различают одномерную, двухмерную или круговую хроматограммы. Движение растворителя по бумаге может осуществляться восходящим, нисходящим или горизонтальным способами. Анализируемую смесь наносят на бумагу в виде капли объемом 1—5 мкл, содержащей 10-8 —10-6 г каждого определяемого вещества. Восходящий или нисходящий поток растворителя перемещает компоненты смеси по бумаге, образуя цепочку (одномерная хроматограмма) или узор (двухмерная хроматограмма) пятен (рис. 3). Содержание каждого изолированного компонента определяют обычными методами после экстракции вещества из «пятна» или реже непосредственно на бумаге но площади пятна, устанавливаемой на основе его окраски, радиоактивности или поглощения веществом ультрафиолетовых лучей.
Рис. 3. Двухмерная хроматограмма смеси важнейших аминокислот, входящих в состав белков и биологических жидкостей. Первый растворитель: бутанол — уксусная кислота; второй растворитель: фенол — NH3. 1 — цистеиновая кислота; 2 — аспарагиновая кислота; в — глютаминовая кислота; 4 — серин; 5 — таурин; в — глицин; 7 — глютамин; 8 — треонин; 9 — аланин; 10 — β-аланин; 11 — оксипролин; 12 — тирозин; 13 — гистидин; 14 — лизин; 15 — аргинин; 16 — метионин-сульфоксид; 17 — ү-аминомасляная кислота; 18 — β-аминоизомасляная кислота; 19 — валин; 20 — фенилаланин; 21 — изолейцин; 22 — лейцин; 23 — пролин.
ГРХ позволяет с предельной точностью анализировать ультрамикроколичества (10-11 — 10-9 г) вещества, которые в условиях анализа могут быть переведены в газо- или парообразное состояние. Она используется для изучения процессов дыхания и состава газов крови, определения половых гормонов, гормонов коры надпочечников, желчных кислот, жирорастворимых витаминов, особенно витаминов группы D (D2 — D3), липидов и некоторых летучих компонентов тканей — низших спиртов, тиолов, кетонов. В биохимии питания ГРХ применяют для идентификации веществ, определяющих запахи пищевых продуктов, например кофе, сыра, жареного мяса и т. д.
Осадочная хроматография. При этой хроматографии происходит образование компонентами смеси нерастворимых осадков вследствие их химического взаимодействия с реагентом, пропитывающим сорбент. В биохимических и клинических исследованиях осадочная хроматография пока применения не находит.
Гелевая фильтрация (ГФ). Разделение веществ методом гелевой фильтрации основано на механическом явлении молекулярного просеивания; при ГФ молекулы, размеры которых меньше диаметра пор однороднопористого набухшего «сорбента», равномерно распределяются между «внешним» и «внутренним» растворами; крупные молекулы не проникают внутрь зерна «сорбента» и, следовательно, перемещаются по колонке со скоростью течения растворителя. В биохимических исследованиях наибольшее распространение получили пористые сополимеры частично деполимеризованного бактериального полисахарида декстрана с различным количеством гидрофобных мостиков, образованных остатками глицерина (сефадексы) или полиакриламида (биогели). Повышение содержания «сшивающего агента» уменьшает размеры пор сита и набухаемость сополимера, снижая поглощение им крупных молекул, обычно веществ с большим мол. весом. Использование сефадексов различных марок позволяет разделять вещества с мол. весом от 200 до 200 000, а биогелей — от 200 до 300 000. «Слабо сшитые» гели применяют для анализа, выделения и очистки белков, полисахаридов, нуклеиновых кислот. «Плотно сшитые» гели позволяют фракционировать аминокислоты, пептиды, сахара, нуклеотиды. Мелкопористые гели используют для отделения низкомолекулярных веществ от высокомолекулярных и заменяют диализ.
Рассмотренные виды хроматографии широко реализуются в варианте тонкослойной хроматографии (ТСХ), при котором тонкоизмельченный сорбент или носитель наносится слоем (0,1 — 0,3 мм) на стеклянную пластинку. Техника получения тонкослойных хроматограмм аналогична хроматографии на бумаге; преимущество — быстрота разделения и высокая чувствительность. ТСХ на силикагелях, Al2O3, кизельгуре, обычной и ионообменной целлюлозах или сефадексах является самым совершенным методом микроанализа. ТСХ используется в биохимических и клинических исследованиях для разделения, идентификации и количественного определения аминокислот, пептидов, углеводов, нуклеотидов, гормонов, жирных кислот, белков и т. д.; так, например, смесь АТФ и АДФ в количестве 5·10—4 мкмоля каждой может быть разделена в тонком слое ЭКТЕола-целлюлозы за 4—5 мин.; смесь четырех нуклеотидов разделяется в этих условиях за 15 мин. В аналитической химии применяют ТСХ, при которой наиболее распространенными сорбентами служат окись алюминия и силикагель.