Ванилилминдальная кислота (определение в моче по В. В. Меньшикову и Т. Д. Большаковой). Конечные продукты обмена адреналина и норадреналина, около 40% которых в моче составляет ванилилминдальная кислота,— продукт оксиметилирования и окислительного дезаминирования этих катехоламинов, выводятся с мочой в 50 раз больше, чем свободные катехоламины.
Реактивы: 1. 3 н. НCl и 1 н. НCl.
2. Этилацетат.
3. Насыщенный раствор NaCl.
4. Абсолютный этанол.
5. Ацетатный буфер рН 6 (5 мл ледяной уксусной кислоты до 1 л воды).
6. Диазотированный паранитроанилин:
а) 0,5 г нитроанилина, 10 мл концентрированной НCl, 490 мл воды растворяют при нагревании. Хранят в холодильнике;
б) 0,2%-ный раствор NaNO2. Хранят в холодильнике;
в) 10%-ный раствор К2СО3.
Перед употреблением на холоду готовят смесь: 1 объем а + 1 объем б, через 4—5 минут 2 объема в.
Смесь годна несколько минут.
7. Раствор метанольной щелочи, 2 части метанола + 1 часть 2%-ного раствора Na2CO3; сливают перед употреблением из расчета 4 мл на пробу.
8. Стандарт ванилилминдальной кислоты; основной водный раствор с концентрацией 100 мкг в 1 мл.
Для построения кривой проводят исследование 0,01; 0,02; 0,03 и 0,04 мл этого раствора, что соответствует 1, 2, 3, 4 мкг стандарта так же, как и 1, 2, 3, 4 мкг проб мочи со стадии электрофореза.
Определение ведется из суточного количества мочи.
Для исследования отбирают 1 мл в пробирку или колбочку с притертой пробкой. 1 н. раствор НCl доводится рН пробы до 1; для очистки от примесей добавляют 1 мл насыщенного раствора NaCl.
Ванилилминдальную кислоту экстрагируют двумя порциями этилацетата по 4 мл, каждый раз встряхивают в течение 1 минуты и отстаивают 20 минут. Этилацетатный слой оба раза сливают в другую колбочку и затем высушивают досуха в легком токе воздуха в водяной бане при 40—50°. Сухой остаток растворяют в 0,2 мл абсолютного этанола (двумя порциями по 0,1 мл, обмывая стенки колбочки) и переносят микропипеткой на ленту из хроматографической бумаги шириной 4 см, длиной 43 см на участке шириной в 1 см в 13,5—14,5 см от катодного конца ленты.
Ленту предварительно смачивают буферным раствором и натягивают в аппарате для электрофореза. Электрофорез проводят в камерах отечественного производства в ацетатном буфере; сила тока . 1 миллиампер на ленту с напряжением 380—420 в в течение 18 часов. Через 18 часов ленты в течение 30 минут фиксируют в сушильном шкафу при 80°, опрыскивают свежеприготовленным красителем — диазотированным паранитроанилином. Затем сушат на воздухе в течение 1—2 часов. Ванилил-миндальная кислота проявляется в виде фиолетовой полоски в 12—14 см от места нанесения к аноду. Эту полоску вырезают, помещают в химическую пробирку и элюируют в течение часа (за это время нужно 2—3 раза энергично встряхнуть пробы) в 4 мл метанольной щелочи.
Затем производится спектрофотометрия пурпурного элюата ванилилминдальной кислоты при 520 ммк или фотоэлектроколориметрия на ФЭКе с зеленым фильтром. В обоих случаях берут кюветы с толщиной слоя 1 см. В качестве контроля используют элюат из опрысканного кусочка ленты шириной 1 см, не содержащего фракций мочи.
Показатели контроля вычитают из опыта, по калибровочной кривой определяют количество микрограммов ванилилминдальной кислоты в 1 мл исследуемой мочи и полученный результат умножают на диурез. Содержание кислоты в сутки или, что удобней для отдельных порций мочи, в микрограммах на 1 мг креатинина, для чего определяют креатинин в моче по методу Яффе.
Этим методом открывается 88,1% добавленного к пробам мочи стандарта; расхождение параллельных проб в среднем составляет ±3,79%.
Нормальные величины ванилилминдальной кислоты: 0,7— 3,8 мг/сут. или 0,6—3,0 микрограмм/мг креатинина.