Микробиологическая диагностика анаэробной инфекции заключается в выделении из исследуемого материала возбудителя [Cl. perfringens, Cl. oedematiens, Cl. septicum, Cl. histolyticum и др. (рис. 1—8)] и его идентификации путем изучения морфологических, культуральных, биохимических, токсигенных свойств.
Для исследования от больного берут кусочки пораженных тканей, жидкость, извлеченную шприцем из раневой зоны, и кровь из вены (5—10 мл). Трупный материал (отделяемое раны, кусочки измененных тканей, кровь из сердца, кусочки печени и селезенки) следует брать не позднее 5—6 часов после смерти, чтобы исключить посмертное обсеменение органов и тканей.
Из всех материалов готовят мазки или мазки-отпечатки и окрашивают их по Граму. Наличие в мазке крупных грамположительных палочек с закругленными концами служит ориентировочным признаком анаэробной инфекции.
Ткани, растертые в ступке с соблюдением правил асептики и разведенные равным объемом физиологического раствора, и жидкие материалы делят на две одинаковые части: одну прогревают 15 мин. при t° 80°, другую — оставляют ненагретой. Из обеих порций производят посев на жидкие мясные или казеиновые среды обогащения под вазелиновым маслом с 1 % раствором глюкозы, прокипяченные в течение 15 мин., и на плотные дифференциально-диагностические среды (кровяной и бензидиновый агары, среды Вильсона — Блера, Виллиса и Хоббс). Посевы на жидкие и полужидкие среды инкубируют в обычном термостате, чашки с плотными средами помещают в микро- или макроанаэростат.
Посевы выращивают в течение 1—4 суток при t° 37°. Рост и максимум токсинообразования у Cl. perfringens наблюдаются через 6—18 час., у Cl. oedematiens — через 48—96 час., у Cl. septicuni и Cl. histolyticum — через 20—36 час. Выросшие культуры микроскопируют и при обнаружении грамположительных палочек проверяют на наличие токсина в реакции нейтрализации. Для этого в 5 пробирок вносят по 0,9 мл центрифугата исследуемой культуры, в первые четыре пробирки добавляют по 0,6 мл одной из антитоксических сывороток (антиперфрингенс, антиэдематиенс, антисептикум или антигистолитикум) с титром 100 АЕ в 1 мл, в последнюю, контрольную, пробирку добавляют 0,6 мл физиологического раствора. Смеси выдерживают 40 мин. при комнатной температуре, после чего вводят из каждой пробирки по 0,5 мл внутривенно или подкожно двум белым мышам. Для морских свинок доза материала должна быть увеличена в 2—4 раза или уменьшена до 0,2 мл при внутрикожном введении. Животные, получившие смесь токсина с гомологичной сывороткой, остаются живы при гибели остальных или у них не наблюдается некроза кожи при внутрикожном введении. Сыворотка, нейтрализовавшая токсин, указывает на видовую принадлежность находящегося в исследуемом материале микроба.
В некоторых случаях, когда из раны выделяется большое количество экссудата, ставят реакцию нейтрализации с центрифугатом раневого экссудата.
Параллельно с исследованием на наличие токсина выросшие культуры пересевают на плотные питательные среды, указанные выше, и инкубируют при t° 37° в анаэробных условиях. Дальнейший анализ посевов на плотных средах аналогичен и состоит в выявлении колоний, вызывающих гемолиз на кровяном, агаре, почернение на среде Вильсона — Блера и на бензидиновом агаре, опалесценцию или просветление на среде Виллиса и Хоббс. Из колоний, типичных для возбудителей анаэробной инфекции, выделяют чистые культуры, которые затем идентифицируют по морфологическим, тинкториальным, культуральным, антигенным и токсигенным свойствам.
Длительность описанных исследований обычно вынуждает решать вопрос о лечебных мероприятиях, не ожидая достоверного микробиологического диагноза анаэробной инфекции. Последний учитывают главным образом при послеоперационном лечении.
Рис. 1. Cl. perfringens A. (Х 1800). Рис. 2. Колонии Cl. perfringens A. на кровяном агаре окружены зоной гемолиза. Рис. 3. Cl. oedematiens (X 1000). Рис. 4. Споры Cl. oedematiens в песке (X 1800). Рис. 5. Колония Cl. oedematiens на печеночном агаре (х 32). Рис. 6. Cl. septicum в виде длинных нитей в печени погибшей морской свинки (X 1800). Рис. 7. Cl. histolyticum (X 1900). Рис. 8. Колонии Cl. septicum на печеночном агаре через сутки после посева (х 32).