Питательные среды

Питательные среды — субстраты, используемые для культивирования в искусственных условиях различных микроорганизмов. Питательные среды широко применяют в повседневной микробиологической практике для постановки лабораторного диагноза инфекционных заболеваний, для выделения микробов из различных предметов внешней среды с целью выяснения источников заражения, а также при эпидемиологическом обследовании людей и животных для выяснения носительства возбудителей инфекционных заболеваний. П. с. применяют также для получения микробных масс, используемых при приготовлении вакцин и диагностических антигенов, в производстве антибиотиков и пр.

Питательная среда, предназначенная для культивирования микробов, должна иметь оптимальные условия для их роста и размножения. С этой целью при создании П. с. предусматривают наличие в них соединений, служащих источниками азота, углерода и водорода, набор необходимых ионов в виде неорганических солей. В ряде случаев в среду добавляют так называемые факторы роста, то есть соединения, которые не синтезируются культивируемым микробом (см. Бактериальные факторы роста). Но наличие в П. с. всех указанных компонентов еще не может обеспечить оптимальные условия для роста и размножения микробов, так как эти процессы зависят также от физико-химических свойств среды. К ним относятся: рН, окислительно-восстановительный потенциал, вязкость, влажность и осмотические свойства.

Если П. с. отвечает биологическим особенностям микроба и обеспечивает его рост и размножение, то ее называют оптимальной или полноценной, если же в ней не хватает какого-либо компонента, необходимого для роста и размножения микроба, такую среду характеризуют как дефицитную. Так как различные виды бактерий и даже штаммы, относящиеся к одному виду, могут значительно отличаться друг от друга по физиологии и характеру обмена веществ, то, естественно, что для их выращивания используют различные питательные среды.



Источником углерода в П. с. служат углеводы, спирты и некоторые органические кислоты, источником азота — минеральные или органические соединения. Очень широко используют пептоны — продукты ферментативного или кислотного гидролиза белков различного происхождения и представляющие собой смесь аминокислот и полипептидов различной сложности. Различия в аминокислотном и пептидном составе пептонов зависят от свойств исходного белка и степени его расщепления. Питательная ценность пептона определяется его аминокислотным и пептидным составом.

Сырьем для изготовления пептонов служат белки мяса, рыбы, дрожжей, казеин и др. Наряду с пептонами как источниками азота в микробиологической практике применяют также мясную воду, которую для выращивания ряда бактерий приготовляют чаще из мяса животных. Для приготовления мясной воды мясо освобождают от костей, сухожилий и жира и перемалывают в мясорубке. Полученный фарш заливают холодной водопроводной водой (на 1 ч. фарша 2 ч. воды), хорошо размешивают и оставляют на сутки в прохладном месте. Мясной настой фильтруют через несколько слоев марли, кипятят и вновь фильтруют через бумажный фильтр, а затем доливают водой до исходного объема.

В пептонах, мясном настое или тканевых экстрактах, кроме органического азота, содержатся бактериальные факторы роста, и поэтому среды, приготовленные на их основе с добавлением соли (NaCl), пригодны для культивирования многих микроорганизмов. Однако для выращивания ряда патогенных микробов (дифтерийная палочка, возбудитель коклюша, бруцеллы и др.) мясопептонная питательная среда непригодна, и поэтому в этих случаях используют специальные среды, например яичные среды с сыворотками, кровью и пр.

В зависимости от свойств, состава и назначения П. с. делят на группы. По консистенции различают питательные среды твердые, полужидкие и жидкие. Примером твердых сред являются 1,5—2% агаровые среды (мясо-пептонный агар, агар Хоттингера), питательная желатина, свернутая сыворотка, свернутый яичный белок, картофель и др. Для приготовления твердых П. с. наиболее часто используют агар-агар, получаемый из морских водорослей. Агар-агар является веществом полисахаридной природы. В воде набухает, образуя студень. Разжижается при t° 70-100° и застывает при 40-50°.

Полужидкой средой является 0,5% агар мясо-пептонный (см.).



К жидким средам относят бульон мясо-пептонный (см.), пептонную воду сахарный бульон, бульон Хоттингера, представляющий собой разведенный (в 4—9 раз) мясной фильтрат, подвергшийся ферментативному гидролизу панкреатином и содержащий 0,5—1% поваренной соли.

Питательные среды бывают простые и сложные. Простыми средами являются пептонная вода, мясо-пептонный бульон, мясо-пептонный агар, питательная желатина. На основе простых сред готовят сложные (мясо-пептонный сахарный бульон, кровяной агар, асцит-агар и др.). Сложность той или иной питательной среды зависит от биологических особенностей выращиваемого микроба, а также от целей исследования. Так, например, для выращивания гемоглобинофильных бактерий используют сложную среду Борде — Жангу, в которой дефибринированную кровь человека или кролика добавляют к картофельно-глицериновому бульону или агару. Многие сложные питательные среды используют для выявления у культивируемого микроба специфических свойств, выражающихся в морфологии колоний, характере роста или в особенностях обмена веществ. П. с., которые позволяют установить специфику микроба, называют дифференциально-диагностическими (см. Дифференциально-диагностические среды). Например, для выявления способности у бактерий расщеплять глюкозу с выделением ацетил-метил-карбинола (реакция Фогеса — Проскауэра) используют среду Кларка, в которой содержатся пептон, глюкоза, К2НРO4 и щелочь (КОН). Ацетил-метил-карбинол в присутствии щелочи и кислорода окисляется в диацетил, а последний, соединяясь с гуанидином, находящимся в пептоне, дает красное окрашивание.

Особую группу составляют селективные среды, в которых создаются наилучшие условия для выращивания определенного вида микробов и неблагоприятные для других видов, например среды Мюллера, Кауфмана, Лифсона, Шустовой для выделения кишечных бактерий, щелочной агар — селективная среда для холерного и холероподобных вибрионов, среды с добавлением антибиотиков дают возможность селекционировать антибиотикорезистентных бактерий от чувствительных. Из перечисленных сред широкое распространение имеет среда Кауфмана, используемая в качестве обогатительной среды для бактерий группы сальмонелл и брюшного тифа. Основными ингредиентами среды являются гипосульфитный бульон, бриллиантгрюн и желчь. Селективность для анаэробных микроорганизмов создается путем снижения в среде концентрации растворенного кислорода. Одной из распространенных питательных сред, используемых для выращивания анаэробов, является среда Китта — Тароцци, в которой роль адсорбента кислорода и редуцирующего фактора выполняют находящиеся в среде кусочки печени животных.

К сложным П. с. относят также синтетические (см. Синтетические питательные среды). Своеобразие сред этой группы выражается в том, что все их компоненты являются химически чистыми соединениями, в отличие от ранее упоминавшихся сред, содержащих в качестве питательных субстратов продукты естественного происхождения (пептоны, кровь, асцитическая жидкость и пр.). Минимальные синтетические питательные среды содержат набор солей, а источником энергии служит глюкоза или молочная кислота, источником азота — аммонийные соли. Такие среды пригодны для выращивания прототрофных микробов. Ауксотрофные микробы, не способные синтезировать какое-либо из жизненно важных соединений (аминокислоту, витамины, пуриновое или пиримидиновое основание), культивируют на средах, содержащих, кроме набора солей, тот или иной дополнительный ингредиент, по которому данный микроб ауксотрофен. Например, если культивируемые бактерии не способны синтезировать триптофан или другую аминокислоту, то к солевой минимальной среде добавляют соответствующую аминокислоту. Обычно 1-аминокислоты вносят в концентрации 20 мкг/мл, а dl-аминокислоты — 50 мкг/мл. Синтетические П. с. используют для изучения физиологии бактерий, в частности обмена веществ, и особенно при изучении некоторых проблем биохимической генетики. Синтетические П. с. применяют и в селекции микробов для отбора ауксотрофных или прототрофных штаммов.

В лабораторных условиях для приготовления, хранения и розлива питательных сред используют бактериальные пробирки, плоскодонные колбы, флаконы и пр.

Для пластинчатых твердых сред применяют чашки Петри. В массовом микробиологическом производстве бактериальные культуры выращивают в металлических котлах (реакторы) большой емкости (500—1000 л).

В посуде, используемой для П. c., нельзя хранить дезинфицирующие вещества, антибиотики, так как малейшие их следы делают среду непригодной для выращивания микробов. Перед употреблением посуду тщательно моют и высушивают. Новую посуду предварительно кипятят в 1 % растворе соляной кислоты и промывают в проточной дистиллированной воде. Питательные среды обычно должны быть прозрачными, поэтому их до употребления фильтруют или отстаивают. Отстоявшиеся расплавленные агаровые среды фильтруют через ватно-марлевый фильтр (при фильтровании через вату качество среды может снизиться за счет адсорбции на ней соединений среды, стимулирующих рост микроба). Жидкие среды фильтруют через фильтровальную бумагу или полотно. Если агар после фильтрования или отстаивания остается мутным, то его осветляют, добавляя яичный белок или сыворотку из расчета на 1 л среды одно куриное яйцо или 20—25 мл сыворотки. Добавленные белки свертываются, адсорбируют взвешенные частицы и, оседая, просветляют среду. Готовые питательные среды разливают в соответствующую стерильную посуду и стерилизуют.

Стерилизация (см.) — весьма ответственный этап приготовления П. с. Режим ее не должен изменять свойства сред. Наиболее распространена и эффективна стерилизация при помощи высокой температуры в автоклавах (см.) под давлением или текучим паром. Обычно П. с. стерилизуют в автоклаве при 1 атм. (120,6°) в течение 15—30 мин., в отдельных случаях и при объемах среды, превышающих 1 л, — в течение 1—1,5 час. Указанным способом пользуются для стерилизации сред, не содержащих углеводы и нативные белки или другие термолабильные субстанции. При наличии в среде термолабильных субстанций пользуются бактериальными фильтрами или дробной стерилизацией. При стерилизации бульонных сред или сред, содержащих другие органические источники питания, возможно изменение рН в кислую сторону на 0,1—0,2.

Готовые питательные среды хранят в холодном и темном помещении с достаточной влажностью. Длительно хранить П. с. нежелательно: плотные среды подсыхают, а в жидких возможно выпадение осадков.

Для стандартизации условий культивирования микробов и облегчения лабораторных работ применяют сухие П. с.— гигроскопические порошки, растворяющиеся в воде. Перед употреблением такие П. с. растворяют в дистиллированной воде и затем стерилизуют.