Сбор и сохранение материала. Так как продолжительность выделения некоторых вирусов очень невелика, при заболевании материал должен быть взят возможно раньше и безотлагательно направлен во льду в лабораторию. В общем смывы из носоглотки, по-видимому, дают большее содержание вирусов, чем мазки из глотки, но последние легче получить и если они берутся с достаточным нажимом, то обычно могут дать удовлетворительные результаты. При инфекциях, вызванных энтеровирусом, фекалии, по-видимому, содержат большее количество возбудителей, чем реактальные мазки. Все мазки следует брать с помощью тампона на деревянной палочке и после проведения манипуляции немедленно погружать в среду для транспортировки, такую, как Hank's BSS. Установлено, что снятое молоко представляет собой средство выбора как среда для транспортировки [3]. Мазки из гортани имеют значение только в том случае, если они взяты в раннем периоде заболевания, т. е. до 5 дней от начала болезни; энтеровирус может быть обнаружен в фекалиях в течение значительно более длительного периода.
Термическая стабильность различных вирусов варьирует в широких пределах. Энтеровирусы могут содержаться неделями при +4° и при —20°, почти не изменяясь. Такие вирусы, как респираторно-синцитиальный и парагриппозные, однако, чрезвычайно лабильны и лучше всего выделяются при выращивании в тканевых культурах, если посев произведен у постели больного или в течение часа после получения материала.
Если материал взят ночью, он может сохраняться при температуре + 4° до утра, когда может быть произведен посев. Если это происходит позже, материал следует заморозить смесью сухого льда и ацетона и сохранять при —70°. Мазки из глотки и прямой кишки, так же как и смывы из носоглотки, вначале обрабатывают антибиотиками, а затем засевают в тканевые культуры. Из материала, полученного при вскрытии и из фекалий, до такого посева изготовляют 10—15% суспензию, которую центрифугируют и обрабатывают антибиотиками.
| Название вирусов | Время идентификации | Среда |
| Гриппозные Парагриппозные Аденовирус Риновирус Респираторно-синцитиальный вирус |
3—21 день 3—21 » 3—30 дней 1—2 месяца 5—21 день |
Куриные эмбрионы, почки обезьян Почки обезьян Клетки HeLa Почки эмбриона человека — WI 33 Клетки HeLa |
Выделение вирусов (таблица 5). Не существует универсальной тканевой культуры для вирусов. Поэтому в лабораториях обычно используют 2— 3 различные системы тканевых культур. Культуры бывают первичными, перевиваемыми или полуперевиваемыми. Первичные культуры непосредственно происходят из тканей и органов человека или животных, например, из почки обезьяны, легкого или из почки человеческого эмбриона, амниона человека или из эпителия полости носа и трахеи эмбриона человека [23, 49]. Эмбриональные ткани особенно чувствительны к вирусам, вероятно, из-за отсутствия интерферона. Большинство перевиваемых куль-тур — гетероплоидные, они происходят из тканей злокачественной опухоли, например HeLa и Нер2, из амниона или клеток легкого плода. Перевиваемые культуры могут сохраняться неопределенное время в виде субкультур. На последние воздействует большое количество вирусов и они представляют собой наиболее используемую форму культуры, потому что они легко доступны. Клетки полуперевиваемой системы культур (например, фибробласты человеческого эмбриона) [18] сохраняют нормальный диплоидный кариотип и могут дать 30—50 субкультур до дегенерации или исчезновения диплоидного характера. Эти культуры очень чувствительны к различным вирусам (таблица 5). Клетки тканевых культур вначале обрабатывают трипсином и затем высевают в пробирки с соответствующей питательной средой. Рост клеток происходит в виде одного сливающегося слоя, в который и вносится патологический материал. Наличие вируса можно определить прямыми и непрямыми методами.
Прямые методы. Многие вирусы оказывают цитопатогенный эффект на клетки культуры (например, аденовирусы, пикорнавирусы) или могут особым образом стимулировать рост клеток (например, респираторно-синцитиальный вирус).
Непрямые методы. Если вирус не оказывает цитопатогенного действия, его можно обнаружить с помощью гемадсорбции или феномена торможения. Например, миксовирусы, гриппозный и парагриппозный, оказывают небольшое цитопатогенное действие на первичную культуру клеток почки обезьяны, но если к культуре добавить разведенную взвесь эритроцитов, то вирусы осаждаются на поверхности клеток и дают реакцию с гемагглютинирующим вирусоспецифическим материалом. Это явление известно как гемадсорбция [51].
Некоторые вирусы не оказывают патогенного действия и не дают гемадсорбции, они могут быть обнаружены с помощью феномена торможения вируса. Он заключается в том, что клетка, поддерживающая рост одного вируса, не может поддерживать рост другого вируса, добавленного к этой культуре. Этот метод использовался на ранних этапах изучения риновируса [22].
Метод бляшек. Зараженная культура клеток иногда покрыта средой, содержащей агар, так что вирус может распространяться только от клетки к клетке, а не через среду. Таким образом, внесение одной частицы жизнеспособного вируса вызывает образование бляшек из поврежденных, разрушенных или измененных клеток, которые могут давать представление о количестве вируса при заражении. Этот метод особенно полезен при обнаружении энтеровируса. Бляшки с трудом образуются таким вирусом, как гриппозный, размножающимся только при высокой степени оксигенации, которую можно получить путем встряхивания верхнего слоя жидкости. Форма бляшек, образуемых некоторыми вирусами, очень характерна, и таким образом может быть распознана смешанная вирусная инфекция.
Серологические исследования. Антитела к вирусам могут быть обнаружены с помощью методов нейтрализации, связывания комплемента или, в некоторых случаях, угнетения гемадсорбции. Нейтрализующие антитела имеют тенденцию к длительному существованию, обеспечивая различные степени защитной реакции против дальнейшей инфекции. Результаты действия различных вирусов на разные группы населения можно установить с помощью определения нейтрализующих антител. Тест угнетения гемадсорбции, который широко применяется для идентификации культур, инфицированных гриппозным и парагриппозным вирусами, вероятно, обнаруживает антитела, близкие к тем, которые выявляются с помощью проб нейтрализации. Связывание комплемента — метод не всегда такой же чувствительный, как метод нейтрализации, но особенно ценен в диагностике респираторных инфекций, так как приготовление антигенов несложно, а результаты можно получить быстро.
Наиболее частым клиническим тестом при респираторных вирусных инфекциях является определение четырехкратного увеличения титра антител в сыворотке через 10— 14 дней от начала заболевания по сравнению с первым днем Заболевания. В настоящее время этот метод не может быть применен для большого количества разновидностей риновируса. Как уже было сказано, некоторые вирусы могут быть культивированы из смывов из глотки, отделяемого носа или фекалий только в первые дни заболевания.
Увеличение титра антител, общих для антигенно родственных вирусов, например парагриппозного вируса и вируса эпидемического паротита, иногда затрудняет определение точного этиологического агента, если вирус не был выделен, а клиническая картина не позволяет установить точный диагноз.
Быстрая диагностика вирусных инфекций. Метод иммунофлюоресценции. Метод флюоресцирующей окраски антител в различных секретах многообещающий; диагноз гриппа и заболевания, вызванного респираторно-синцитиальным вирусом, так же как микоплазмы и риккетсиозов, был установлен спустя 2—5 часов после получения материала от больного [20]. Материал должен быть взят на возможно более ранних стадиях заболевания, кроме того, необходимы специфические сыворотки с высоким титром антител для уменьшения неспецифической флюоресценции.
Электронная микроскопия. Она открывает большие возможности в ранней диагностике вирусных инфекций, особенно со времени введения новых методов [43]. Однако для этого метода необходимо содержание больших количеств вируса в материале. Таким образом, он может быть очень ценным при таких заболеваниях, как натуральная оспа.
На настоящей стадии развития методы, пригодные для быстрой диагностики вирусных заболеваний, не кажутся приемлемыми для инфекций верхних дыхательных путей, так как небольшое, количество респираторных вирусов затрудняет идентификацию их экстрацеллюлярных форм в отделяемом дыхательного тракта.