Большинство методов сводится к испытанию действия растворенного фермента на субстрат при стандартизованных условиях. Продукты реакции можно определять химическим, манометрическим, спектрофотометрическим, потенциометрическим, полярографическим, флуоресцентным или радиохимическим методами.
Количество фермента указывают в единицах, которые для некоторых ферментов утверждены в международном масштабе. К сожалению, в ряде случаев для одного и того же фермента предложено много различных единиц в зависимости от метода определения. Многие авторы пользуются собственными методами и стандартами, что приводит к путанице. Точное сравнение различных единиц и перевод одних единиц в другие невозможны.
Для того чтобы избежать путаницы, Комиссия по ферментам Международного биохимического союза и секция клинической химии Международного союза теоретической и прикладной химии в 1959 г. приняли новую стандартную единицу активности фермента. Эта единица определяется как количество фермента, которое катализирует превращение 1 мкмоля субстрата за 1 мин при 25 °С в оптимальных условиях концентрации субстрата, рН и ионной силы буферных систем. Удельная активность определяется как активность 1 мг данного фермента. Ферменты можно также выявлять (и оценивать количественно) в срезах тканей (гистохимические методы).
Определение активности ферментов имеет большое значение в диагностике заболеваний и при наблюдении за течением болезни. В большинстве случаев ферменты действуют только на один компонент рацемических веществ — обычно на тот, который встречается в природе. Эта специфичность важна для стереохимии, так как она дает возможность разделять рацематы на оптические антиподы.