Достижения биохимии в 20 веке связаны прежде всего с изучением белковых веществ. Громадную роль в изучении аминокислотного состава белков сыграл разработанный в 1903 г. М. С. Цветом (Россия) хроматографический анализ, нашедший широкое признание в 40-х годах (см. Хроматография). Советские ученые Б. И. Збарский и С. Р. Мардашев разработали микробиологический метод определения аминокислот в организме, основанный на том, что микробы для своего питания нуждаются в определенном ассортименте аминокислот. Этот метод дал возможность не только качественного, но и количественного определения аминокислот. Для выяснения общей структуры молекул белков большую роль сыграло применение электрофоретических методов исследования (см. Электрофорез), рентгеноструктурного анализа, ультрацентрифугирования (см.) и электронного микроскопирования. Благодаря изобретению ультрацентрифуги [А. В. Думанский (Россия), 1912; Т. Сведберг (Швеция), 1923] удалось расшифровать структуру ряда белков.
Ф. Сангер (Англия) положил начало современной структурной химии белка. Им, в частности, установлено строение инсулина (1945—1956). Эти исследования позволили решить проблему связи между структурой молекулы и ее биологической функцией, а также стимулировать развитие новой отрасли науки — молекулярной биологии.
К началу 30-х годов благодаря работам немецкого ботаника Р. Вильштеттера и шведского ученого Г. Эйлера стало ясно, что ферменты являются сложными химическими телами, состоящими из коллоидного носителя белковой природы и небелковой группы (кофермента). В эти же годы получены методом высаливания при низкой температуре уреаза (Д. Б. Самнер, 1926) и ряд пищеварительных ферментов в кристаллическом виде (Д. Нортроп и М. Кунитц, 1930—1931) и установлена их химическая природа. Эти ферменты оказались сравнительно простыми белками. Советские ученые В. А. Энгельгардт и М. Н. Любимова (1939) доказали, что миозин, составляющий основу сократительного вещества мышцы, осуществляет химическую реакцию, доставляющую энергию для мышечного сокращения. Это открытие легло в основу одного из важнейших положений общей биохимии — о трансформировании энергии окислительных процессов в химическую энергию фосфорных соединений, в первую очередь аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ), и превращений в живой клетке химической энергии в механическую (см. Обмен веществ и энергии, Окисление биологическое).
В 1937 г. советскими учеными А. Е. Браунштейном и М. Г. Крицман доказана возможность перехода белковых соединений в безбелковые и обратно (переаминирования). Этим важным открытием доказано, что в определенных условиях происходит превращение, переход друг в друга всех основных органических веществ: белков, углеводов, жиров. Начатые в конце прошлого столетия в России В. И. Палладиным и А. Н. Бахом работы по выяснению механизма окислительных процессов в живых организмах привели в середине 20 века к расшифровке многих этапов клеточной энергетики. В. А. Энгельгардт (1932) впервые указал на роль процессов фосфорилирования для накопления легко мобилизуемых запасов энергии в организме. А. В. Палладии с сотр. изучал влияние физической работы и различных пищевых рационов на химический состав мышцы. А. В. Палладии же положил начало биохимии нервов. Большое значение для успешного развития функциональной биохимии имела сравнительная биохимия. Одним из видных представителей этой науки в нашей стране являлся В. С. Гулевич (1867—1933).
В особое направление биохимии выделилась в настоящее время медицинская химия. В 1907 г. шведский ученый И. Банг разработал методы определения различных веществ в малых количествах исследуемого субстрата (кровь, сыворотка и т. д.). Это дало возможность широко проводить различные биохимические исследования в клинике и имело большое значение для диагностики и лечения.
В 30-х годах 20 века возникла как самостоятельная наука цитохимия. В течение последних 10 лет было обнаружено, что в строении хромосомы лежит белковая основа и ДНК и что последняя является материальным носителем наследственной информации. Исследования в этом направлении привели к возникновению новой дисциплины — молекулярной генетики (см.). Генетика не только предугадала генную структуру наследственной передачи признаков, но и разгадала природу ряда наследственных болезней, а для некоторых из них (галактоземия, фенилкетонурия и др.) были найдены пути лечения. В 20 веке возникло учение о витаминах (см.) — витаминология. В 1906 г. английский биохимик Ф. Хопкинс (1861 —1947) установил, что кормление крыс искусственным молоком вызывало у них замедление роста, а добавление натурального молока нормализовало их развитие. В 1911 —1912 гг. польский биохимик К. Функ, работавший в Англии, выделил из рисовых отрубей тиамин — вещество, которое излечивало больных бери-бери. Это вещество обладало свойствами аминов, в связи с чем было названо Функом витамином. Было установлено, что все витамины принимают участие в функции различных ферментных систем, расшифрован патогенез многих авитаминозов и найдены пути их предупреждения.