В зависимости от свойств объекта свет изменяет свои физические свойства — цвет (длину волны), яркость (амплитуду волны), фазу, используются в современных микроскопах для создания контраста.
Для микроскопии окрашенных объектов пользуются самым простым из известных микроскопов — так называемым обычным (рис. 1). Так как глаз и фотопластинка легко улавливают различия в окраске прошедшего луча, не требуется никаких дополнительных усилий для рассмотрения и съемки цветного изображения. Цвет изображения имеет огромное познавательное значение, ибо по взаимодействию объекта с краской можно судить о его химической природе. Изменяя режим окрашивания, вводя дополнительные обработки растворителями, фиксаторами, коагулянтами и другими веществами (см. Гистологическая техника), добиваются весьма точных, в том числе количественных, знаний о природе объекта и его химизме. На этом основаны бурно развивающиеся гисто- и цитохимия, которые немыслимы без микроскопии. Многие диагностические приемы практической медицины основаны на микроскопии окрашенных объектов. В патогистологии, инфекционной патологии, паразитологии применяют такие специфичные красители, методы обработки микропрепаратов и режимы окраски, что часто бывает достаточно одного взгляда в микроскоп для постановки диагноза или оценки результатов лечения.
Рис. 1. Микроскоп МБИ-3: 1 — ножка, или башмак; 2 — барашки грубого движения тубуса; 3 — тубусодержатель; 4 — окуляры; 5 — бинокулярная насадка; 6 — головка для крепления револьвера с посадочным гнездом для смены тубусов; 7 — винт крепления бинокулярной насадки; 8 — револьвер на салазках; 9 — объективы; 10 — предметный столик; 11 — барашек продольного движения препаратодержателя; 12 — барашек поперечного движения препаратодержателя; 13 — апланатический конденсор прямого и косого освещения; 14 — центрировочные винты столика; 15 — головка винта, фиксирующего верхнюю часть предметного столика; 16 — кронштейн конденсора; 17 — барашек микромеханизма; 18 — зеркало; 19 — коробка с микромеханизмом.
Наиболее легко поддаются окрашиванию фиксированные, убитые препараты. Такие неподвижные препараты могут быть с высокой точностью рассмотрены и сфотографированы через микроскоп, но они не дают возможности оценить различные формы жизнедеятельности микроскопируемого объекта (движение, слияние, фагоцитоз и пр.). Известны красители, которые связываются с живыми клетками, не нарушая их жизнедеятельности.
Витальная (прижизненная) микроскопия показывает, что многие структуры живой клетки сравнительно мало изменяются при умелой фиксации и последующем окрашивании. Этим подтверждается высокая научная ценность информации, получаемой при помощи микроскопии окрашенных объектов. Витальная микроскопия возможна и без окрашивания, если в обычный микроскоп ввести так называемый темнопольный конденсор. Он освещает объект так, что в глаз наблюдателя попадают только те лучи, которые рассеялись на частицах объекта и тем самым изменили направление своего распространения. Лучи, прошедшие через фон без рассеяния, в глаз не попадают. Поэтому частицы объекта светятся и ярко выделяются на темном фоне (темном поле). Частицы объекта хорошо видны, даже если их размеры меньше разрешаемого расстояния.
Темнопольная микроскопия обеспечивает наибольший возможный контраст изображения, но четкость его и полезное увеличение заметно ниже, чем при обычной микроскопии. Темнопольная микроскопия успешно применялась для изучения спирохет, лептоспир и других слабо окрашиваемых микроорганизмов. При работе с гистологическими препаратами она неприменима.
Технически самостоятельным вариантом темнопольной микроскопии является ультрамикроскопия, при которой мельчайшие изучаемые частицы освещаются мощным боковым пучком света и видны точками на черном фоне. Ультрамикроскопия позволяет подсчитывать частицы, оценивать их размеры и другие свойства. Применяется для изучения коллоидных растворов, аэрозолей, суспензий.
В последние годы темнопольная микроскопия применяется все реже, так как появились два новых типа контрастирующих приборов со значительно лучшими характеристиками — фазово-контрастный (рис. 2, а и б) и амплитудно-контрастный микроскопы. Технически они сходны, но в них используют различные изменения светового луча в объекте. Луч, прошедший через фон образца, в идеальном случае не претерпевает никаких изменений. Он проходит через точно определенные участки объектива. Луч, прошедший через объект, подвергается дифракции, т. е. распадается на пучки убывающей интенсивности, которые выходят из объекта под разными углами. Другие свойства луча (амплитуда, длина волны, фаза) изменяются в различных степенях в зависимости от особенностей объекта.
Рис. 2. Микроскоп МБИ-3 (а) с фазово-контрастным устройством КФ-1 (б): 1 — конденсор револьверной системы; г — набор объективов и кольцевых диафрагм; 3 — вспомогательный микроскоп.
Почти все живые микроскопические объекты выглядят в обычном микроскопе едва заметными, прозрачными, потому что они почти не изменяют ни амплитуды, ни цвета прошедшего через них луча.
Они изменяют только фазу его волны, но это изменение не улавливается ни глазом, ни фотопластинкой. Пучок лучей, дифрагированных объектом и сдвинутых им по фазе, проходит через те участки объектива, где не могут пройти прямые, недифрагированные лучи фона. Практически нетрудно определить, где именно пройдут эти лучи. Если накрыть этот участок одной из линз объектива полупрозрачной пластинкой, способной изменить фазу, интенсивность, цвет или все эти три свойства вместе, то изображение фона изменит свою фазу, уменьшится его яркость или преобразится цвет. Лучи, прошедшие через объект и отклоненные (дифрагированные) им, обойдут вложенную в объектив пластинку и, следовательно, не приобретут тех свойств, которые приобрели, пройдя через пластинку, лучи фона. В результате разница между лучами фона и объекта возрастет. Если разница фаз между лучами фона и объекта достигает 1/4 длины волны, то в конечном изображении возникает заметный для глаза и фотопластинки контраст: темный объект на светлом фоне или, наоборот, в зависимости от структуры пластинки, которую в этом случае называют «фазовой». Если же пластинка изменяет главным образом яркость и цвет фона, то такой микроскоп следует назвать амплитудно-контрастным (большое распространение получило более короткое, хотя и не совсем правильное название «аноптральный»). Таким образом, разница между фазово-контрастным и амплитудно-контрастным микроскопом определяется свойствами пластинки в объективе, изменяющей свойства недифрагированных лучей фона. Изображения, построенные этими микроскопами, значительно ярче и богаче деталями (рис. 3 и 4), чем темнопольные картины.
Рис. 3. Культура многоклеточной бактерии Caryophanon latum Peshkoff. Амплитудно-контрастная микроскопия.Рис. 4. Микроколонии Вас. megatherium, зараженной фагом. Амплитудно-контрастная микроскопия.
С появлением фазово- и амплитудно-контрастных микроскопов витальная микроскопия получила прекрасную технико-методическую базу, возможности которой близки к предельным для световой оптики. Никакой фиксации или окраски объекта эти приборы не требуют. Современная витальная микроскопия чрезвычайно расширила наши знания о поведении и динамике живых микрообъектов в естественных и лабораторных условиях обитания и эксперимента. Ускоренная (рапид) и замедленная (цейтрафферная) микрокиносъемка сделали доступными для исследования процессы, скорость течения которых слишком велика или слишком мала для визуального наблюдения.
Выпускаемые промышленностью фазово-контрастные и амплитудно-контрастные (аноптральные) устройства недороги, легко монтируются на серийных микроскопах; использование их не представляет затруднений. Эти приборы, несомненно, будут находить все новые области применения как в научных исследованиях, так и в медицинской практике.
Ультрафиолетовая микроскопия основана на способности некоторых веществ избирательно поглощать ультрафиолетовые лучи с определенной длиной волны. Это позволяет наглядно демонстрировать и изучать, в том числе количественно, распределение веществ в живых клетках или фиксированных препаратах. Так, например, белки и нуклеиновые кислоты одинаково прозрачны для видимого света; рассматривая неокрашенную клетку в видимом свете, нельзя определить, где расположен белок или нуклеиновая кислота. Но ультрафиолетовые лучи определенной длины нуклеиновая кислота поглощает значительно сильнее, чем белок. Поэтому в ультрафиолетовом микроскопе участок, содержащий нуклеиновую кислоту, выглядит значительно темнее. Так как ультрафиолетовые лучи непосредственно глазом не воспринимаются, приходится применять специальные преобразователи света. Ультрафиолетовая микроскопия технически значительно сложнее обычной световой, ее аппаратура дороже и методика тоньше. Несмотря на это, применение ее оправдано, так как научная значимость быстрого топографического описания химического состава живой клетки весьма велика.
Гораздо более доступна и перспективна люминесцентная микроскопия (см.), широко применяемая ныне в научно-исследовательских и клинико-диагностических лабораториях. При этом живой объект обрабатывают специальными красителями, которые, будучи освещены синим, фиолетовым или ультрафиолетовым светом, начинают светиться, излучая более длинные волны (зеленые, желтые). Цвет возбужденного вторичного свечения зависит от химических свойств объекта и введенного в него красителя.
Поляризационная микроскопия основана на изменении плоскости колебаний световой волны после прохождения через кристаллы. В практической медицине не применяется.
Современная микроскопия требует применения разнообразной вспомогательной аппаратуры. Нагревательные столики и термостаты позволяют выдерживать и наблюдать объект длительное время при заданной температуре. Для длительного выращивания микробов или тканевых культур в поле зрения сильного объектива служат разнообразные микрокамеры. Окулярные и объективные микрометры делают возможными точные измерения микрообъектов. Промышленность выпускает микроманипуляторы (см.) для операций на микрообъектах. Для получения стереоскопического изображения при увеличениях до 100 раз предназначены бинокулярные лупы (см.) и стереомикроскопы (рис. 5). Широко производится и используется аппаратура для микрофотографии и микрокиносъемки (рис. 6). См. также Микроскопическая техника.
Рис. 5. Стереоскопический микроскоп МБС-1.
Рис. 6. Микрокиноустановка МКУ-1.