17-Оксикортикостероиды в плазме крови (определенна по Портеру и Силберу, модификация Н. А. Юдаева и Ю. А. Папкова), Описанный Портером и Силбером метод позволяет определять только свободные 17-оксикортикостероиды в плазме крови. Однако значительная часть этих веществ находится в периферической крови в соединении с глюкуроновой и серной кислотами. Поэтому их можно определять после предварительного их гидролиза. Дополнение М. С. Суровикиной в модификацию Н. А. Юдаева и Ю. А. Панкова заключается в том, что оно позволяет определять свободные и связанные с серной и глюкуроновой кислотами 17-оксикортикостероиды.
Реактивы и оборудование. Хлороформ, 1 л которого встряхивают в течение суток со 100 мл концентрированной серной кислоты; эту операцию повторяют дважды. Затем хлороформ также путем встряхивания в течение 1—2 часов промывают водой, концентрированным аммиаком, снова водой, разбавленной в 3 раза серной кислотой, насыщенным раствором соды, высушивают над безводной содой и отгоняют с дефлегматором. Все материалы для промывания берут в количестве в 10 раз меньшем, чем количество хлороформа. Обработку производят в полной темноте, для чего используемую стеклянную посуду обертывают черной светонепроницаемой бумагой. Очищенный таким образом хлороформ может храниться в полной темноте в течение месяца.
0,2 н. раствор Na2СО3.
Концентрированная, химически чистая серная кислота.
Разбавленная серная кислота—190 мл воды смешивают с 310 мл концентрированной серной кислоты.
Перегнанный этиловый спирт.
Фенилгидразин солянокислый, дважды перекристаллизованный из спирта.
Фенилгидразиновый реактив. Перекристаллизованный фенилгидразин растворяют в смеси из 100 мл разбавленной серной кислоты и 50 мг этилового спирта. Реактив готовят перед употреблением.
Стандартный раствор гидрокортизона (0,5 микрограмм кортизона в 1 мл); 1 мг гидрокортизона растворяют в 5 мл метанола и доводят водой до 2 л.
Делительные воронки на 100—150 мл. Мерные пробирки емкостью 3 мл с внутренним диаметром 11—13 мм. Спектрофотометр СФ-4. Кварцевые микрокюветы размером 3x8x20 мм.
Диафрагма к спектрофотометру, позволяющая вычленить луч диаметром в 1 мм. Диафрагма представляет собой круглую пластинку толщиной 3 мм, сделанную по величине выходного отверстия в кожухе спектрофотометра. В 2 мм от ее центра делают отверстие диаметром в 1 мм для прохождения луча. Диафрагму вставляют в выходное отверстие спектрофотометра. Поворотом ее вокруг оси подбирают такое положение, когда через отверстие ее проходит максимальное количество световой энергии. После этого делают соответствующие метки на диафрагме и кожухе спектрофотометра, и в дальнейшем каждый раз перед началом измерений диафрагму устанавливают в приборе таким образом, чтобы метки на ней и на спектрофотометре совпадали.
Микрокювету с помощью дополнительного футляра устанавливают в кюветодержатель таким образом, чтобы при помещении последнего в спектрофотометр луч, вычлененный диафрагмой, проходил через кювету у самого ее дна. Такое положение микрокюветы дает возможность измерять оптическую плотность в 0,1—0,2 мл исследуемого раствора.
Ход определения. Берут 5 мл плазмы (можно брать и меньше, по доводить до 5 мл водой) крови человека, встряхивают в делительной воронке в течение минуты с 25 мл хлороформа. Смесь отстаивается, и плазма отбрасывается. Хлороформный экстракт промывают сначала 2,5 мл 0,2 н. раствора Na2CO3, а затем 2,5 мл дистиллированной воды.
Из конечного хлороформного экстракта берут 20 мл и отгоняют до 1,0—1,5 мл в вакууме при температуре не выше 40° в водяной бане. Полученный прозрачный остаток переносят в мерную пробирку на 3 мл, колба обмывается небольшим количеством хлороформа, который также переносится в мерную пробирку так, чтобы весь объем хлороформа был 3 мл. Затем в пробирку добавляется 0,2 мл фенилгидразинового реактива, проба дважды встряхивается в течение 1 минуты. Отстаивается не более 20—30 минут. Хлороформ при этом оказывается внизу и удаляется с помощью капиллярной пипетки, соединенной с водоструйным насосом. Для этого пипетка при работающем насосе быстро вводится в пробирку до дна ее и, после того как будет удалено более 2/3 жидкости, быстро вынимается. Оставшийся хлороформ после этого обычно вытесняется на поверхность и легко удаляется с помощью той же пипетки. Если же он не вытесняется, то наклоном пробирки в сторону можно легко этого добиться. Надо отметить, что чем тоньше используется пробирка, тем ею лучше пользоваться. Хлороформ обычно трудно удаляется после длительного стояния пробирки или в случае, когда он недостаточно хорошо очищен. Отстоявшийся фенилгидразиновый реактив в дальнейшем инкубируется в течение 30 минут в термостатической водяной бане при 60°, охлаждается 2—3 минуты в холодной воде, и оптическая плотность пробы определяется с помощью микрокюветы на спектрофотометре СФ-4 при длинах волн 370, 410 и 450 миллимикрон (колориметрировать необходимо сразу же после инкубации в бане). В качестве контроля служит чистый фенилгидразиновый реактив, проинкубированный при 60°.
Заполняют микрокюветы при помощи капиллярной пипетки. Не обязательно промывать их после каждого определения, если пробы не сильно отличаются друг от друга по окраске. Если пробы очень концентрированы, кювету нужно промывать без фенилгидразинового реактива, а саму пробу разводить этим же реактивом до тех пор, пока можно будет определить ее оптическую плотность.
Параллельно с пробой плазмы такой же обработке подвергается стандарт. Последний представляет собой водный раствор гидрокортизона или его ацетата, в 1 мл которого содержится 0,5 у гормона. К одной серии проб плазмы можно брать два стандарта: 0,5 и 1 γ (лучше с параллелями, т. е. 1 и 2 мл раствора и доводить их до 5 мл водой). Оптическая плотность стандарта определяется при тех же длинах волн.
Измерение начинают с определения оптической плотности стандарта, сначала при длине волны 370 миллимикрон, затем 410 и лишь после этого при 450 миллимикронах. Такой способ расчета основан на способности 17-оксикортикостероидов образовывать после обработки фенилгидразином вещество с максимумом поглощения при 410 миллимикронах.
Для расчета содержания 17-оксикортикостероидов в плазме (у%) необходимо знать коэффициент К и величину Q. Коэффициент К вычисляется по формуле
где Д — оптическая плотность раствора при определенной длине волны. Величину Q вычисляют по формуле
где Р — количество стандарта гидрокортизона, мг; К — коэффициент стандартной пробы; Q вычисляют в каждой параллели стандарта и ко всем стандартам (0,5 и 1 γ) и берут среднюю величину, которой пользуются при расчете опытных проб. Следовательно, Q — единая величина для всех проб, а К находится для всех проб. Количество 17-оксикортикостероидов (А) определяется по формуле 3·A=K·Q. Зная количество 17-оксикортикостероидов в исследуемом объеме плазмы, вычисляют их процент в гаммах.
Определение 17-оксикортикостероидов, связанных с глюкуроновой кислотой. Берут 1 мл плазмы, приливают 1 мл раствора β-глюкуронидазы, содержащего 1000 ЕД, прибавляют 2 мл ацетатного буфера рН 4,5 и 1 мл дистиллированной воды, чтобы вся смесь составляла 5 мл. Смесь ставят в термостат при температуре 37° на 18 часов.
После гидролиза плазму обрабатывают и рассчитывают так же, как при определении свободных 17-оксикортикостероидов.
Определение 17-гидрооксикортикостероидов, связанных с серной кислотой. Для определения используется не свежая плазма, а часть плазмы, оставшейся после определения 17-оксикортикостероидов, связанных с β-глюкуроновой кислотой. Смесь с плазмой подкисляется 20%-ной серной кислотой до рН 1—2 и затем подвергается точно такой же обработке, как и в предыдущих определениях.
В норме количество свободных 17-оксикортикостероидов равно 11—13 микрограмм%. Сумма свободных и связанных с глюкуроновой кислотой 17-оксикортикостероидов равна 8—25 микрограмм%, связанных с серной кислотой—8—12 микрограмм%.