Расчет содержания 17-оксикортикостероидов в моче

Расчет содержания 17-оксикортикостероидов в моче (по формуле Креховой). Количество свободных 17-оксикортикостероидов в моче, а) Количество 17-оксикортикостероидов в пробе без гидролиза рассчитывают из соотношения

откуда

где x1— количество 17-оксикортикостероидов в пробе без гидролиза (в микрограммах); P1 — оптическая плотность опытной пробы без гидролиза; Р2 — оптическая плотность контрольной пробы без гидролиза; С — количество кортизона или гидрокортизона (стандарта) в микрограммах; Р3 — оптическая плотность стандарта.

Если отношение Ст/P3 выразить через Q, формула приобретает вид
x1 = (P1—P3)Q.

6) Количество 17-оксикортикостероидов в суточной моче рассчитывается следующим образом:

где B1 — количество 17-оксикортикостероидов в суточной моче; x1/[10·2/3] — количество свободных 17-оксикортикостероидов в 1 мл мочи  (в микрограммах); А — суточное количество мочи.

Количество суммарных 17-оксикортикостероидов в суточной моче, а) Количество 17-оксикортикостероидов (в микрограммах) в пробе после гидролиза рассчитывают так же, как и при расчете количества 17-оксикортикостероидов в пробе без гидролиза по формуле:
x2—(Р — пробы после гидролиза — Р-контроля после гидролиза).
б) Количество суммарных 17-оксикортикостероидов в суточной моче (в миллиграммах) рассчитывают по формуле

где x2/5 · 2/3 — количество суммарных 17-оксикортикостероидов в 1 мл мочи.

Определение 17-оксикортикостероидов в моче, связанных с серной кислотой. Остаток мочи после β-глюкуронидазного гидролиза подкисляют 20%-ной серной кислотой до рН 1 по индикатору Рифан. Подкисленную мочу выливают в делительную воронку, прибавляют 150 мл хлороформа и встряхивают 3 минуты. Хлороформные экстракты, содержащие 17-оксикортикостероиды, связанные с серной кислотой, делят пополам, обрабатывают так же, как и предыдущие анализы для свободных и связанных 17-оксикортикостероидов и готовят к колориметрии. Расчет ведут на 5 мл мочи.

Приготовление растворов для проведения цветной реакции. Разбавленная серная кислота —310 мл концентрированной (выдерживающей пробу Саваля) серной кислоты добавляют к 190 мл серной кислоты (осторожно, так как идет сильное разогревание). Этот реактив готовят заранее. Спиртовой раствор серной кислоты — к 50 мл охлажденной разбавленной серной кислоты прибавляют 25 мл абсолютного этанола. Спиртовой раствор серной кислоты с фенилгидразином — берут 13 мг перекристаллизованного дважды из спирта солянокислого фенилгидразина и растворяют в 20 мл абсолютного этилового спирта (или 65 мг фенилгидразина на 130 мл спиртового раствора серной кислоты). Реактив готовят перед употреблением.

Приготовление стандарта гидрокортизона  (ацетата) для 17-оксикортикостероидов. Готовят основной раствор кристаллического кортизона, гидрокортизона или их ацетата (10 мг кортизона или гидрокортизона равны 11,2 мг кортизона-ацетата или гидрокортизона-ацетата). С этой целью растворяют в 100 мл химически чистого метанола 20 мг кристаллического гормона. Затем 1 мл основного раствора, содержащего 200 γ, разводят в десять раз метиловым спиртом, и по 1 мл этого раствора, содержащего. 20 γ, помещают в пробирку и выпаривают (на воздухе, в азотной струе или жидкой углекислоте).

В случае определения оптической плотности на ФЭКе необходимо к фильтру № 3 приготовить жидкие светофильтры А и Б. Первый сострит, из 96 мл 0,83%-ного марганцовокислого калия и 4 мл дистиллированной воды. Данный раствор наливают в кювету с толщиной слоя в 1 мм. Фильтр Б состоит из 80 мл 25%-ного медного купороса и 20 мл дистиллированной воды. Раствор наливают в кювету с толщиной слоя в 5 мм. Фильтры ставят по ходу светового луча — сначала фильтр А, затем фильтр Б. В сочетании с фильтром № 3 ФЭКа жидкие фильтры А и Б дают длину волны, равную 400— 405 миллимикрон.

Фермент выделяют из печени телят экстракцией ацетатным буфером при рН 5,0 и осаждают сернокислым аммонием по методу   Фишмана. Для этого доставленную с бойни печень очищают от соединительной ткани и измельчают на мясорубке 1 кг фарша; порциями по 200 г гомогенизируют со 130 мл ацетатного буфера (рН 5), ионная сила равна 0,07. Гомогенат (приблизительно 1800 мл) оставляют на ночь при температуре 38° на автолиз. На следующий день центрифугированием при 3000 оборотах в минуту отделяют осадок. Фермент содержится в центрифугате. Осадок промывают 350 мл ацетатного буфера, вновь отделяют центрифугированием, центрифугат соединяют с первым. Фермент высушивают из экстракта добавлением сухого порошка (NH4)2SO4 из расчета 733,0 на 2200 мл (приблизительно 80% насыщения), перемешивают 30 минут и выдерживают ночь при температуре 4°. Выпавший осадок отделяют центрифугированием при 3000 об/мин. в течение 20 минут. Для дальнейшей очистки и удобства хранения препарата и использования обрабатывают полученный осадок ацетоном (двойным объемом), центрифугируют, осадок собирают и взмучивают еще раз с тем же объемом ацетона и вновь отделяют на центрифуге. Ацетон сливают, осадок высушивают на воздухе. Сухого осадка примерно остается 10—15 г. Обработка ацетоном не только дает возможность быстро высушивать препарат, но и увеличивает активность, что, возможно, объясняется удалением ингибитора или освобождением активных групп фермента. Хранить препарат нужно на холоду или над P2O3 в эксикаторе.

Если в качестве стандарта применяется не гидрокортизон, а кортизон, то для перевода оптической плотности кортизона в оптическую плотность гидрокортизона необходимо первую умножить на коэффициент 3, так как кортизон дает в 3 раза слабее окраску, чем гидрокортизон.

Если в качестве стандарта берется гидрокортизон-ацетат, то для перевода его оптической плотности в оптическую плотность гидрокортизона необходимо оптическую плотность гидрокортизона-ацетата умножить на коэффициент 1,12, поскольку кортизон дает в 1,2 раза слабее окраску, чем гидрокортизон-ацетат.