Обычный световой микроскоп не позволяет выявить многие особенности строения спермиев, так как в процессе подготовки мазка спермы к осмотру семенные нити подвергаются значительным воздействиям физических и химических факторов, приводящих к их сморщиванию и деформации.
Среди новых методов микроскопии большое распространение получил метод фазового контрастирования, который был впервые описан Bratuschek (1892) и Kohler (1893). Изображение возникало в результате фазового контраста при прохождении света через пластинку со слоем копоти. Сущность метода фазово-контрастного микроскопирования, применяемого в настоящее время, заключается в искусственном изменении хода световых лучей, освещающих препарат, внесением в систему микроскопа фазового контрастора. Последний состоит из набора специальных ахроматических фазовых микрообъективов, конденсора, револьверного диска с кольцевыми диафрагмами, установленными перед конденсорами, и вспомогательного микроскопа для настройки установки.
Nordlander (1948), Oettle (1950), Joel (1954), сравнивая результаты исследования высушенных и окрашенных мазков спермы под обычным световым микроскопом с результатами наблюдений только высушенных и свежих препаратов эякулята с помощью фазово-контрастной микроскопии, пришли к выводу, что этот метод осмотра позволяет выявить более тонкие морфологические особенности спермиев. По Vasterling (1960), морфологию семенных нитей вполне можно изучать и в неокрашенном мазке при помощи фазово-контрастной микроскопии при 500-кратном увеличении. При исследовании спермиев с помощью фазово-контрастного микроскопа мы смогли без окраски препарата ясно видеть семенные нити и производить их морфологическую оценку (рис. 13). Однако фазово-контрастный микроскоп обладает малой разрешающей способностью. Наибольшее увеличение дает электронный микроскоп.
Рис. 13. Нормальный спермий при фазово-контрастной микроскопии.
Ув. Х 900.
Впервые электронную микроскопию спермы произвели и описали в 1941 г. Seimour и Benmosche. Они видели все части спермин. Усовершенствование методики исследования позволило Baylor и соавторам (1943) видеть протоплазматический слой, окружающий головку семенной нити. Schmitt и соавторы (1943) насчитали в хвостовой части спермия от 9 до 11 фибрилл. Zworykin и соавторы (1945) усовершенствовали методику электронной микроскопии. В 1948 г. Read уже смог определить в теле семенной нити человека до 10—12 спиральных витков. В дальнейшем появилось много работ по исследованию спермиев с помощью электронного микроскопа (С. А. Каган, 1963; Bayle, Bessis, 1951; Schulz-Larsen, 1958; Bessis et al., 1958, и др.), в которых подтверждена сложная структура осевой нити хвоста спермия. Эта нить состоит из 9 фибрилл, как бы образующих ее наружный футляр, и 2 фибрилл, занимающих центральное положение (рис. 14).
Рис. 14. Электронномикроскопическая схема строения спермии человека (по Culp, Best, 1949).
Bayle (1953) указывает, что исследование морфологии семенных нитей при помощи электронного микроскопа трудно из-за сравнительно большой толщины головки спермия. Все же подобная методика, по заключению автора, дает возможность рассмотреть некоторые детали формы семенной нити, которые не видны при простом микроскопировании.
С. А. Каган (1963) отмечает, что в норме содержимое головок спермиев имеет гомогенный характер, а при патологии — зернисто-фибриллярный, что свидетельствует о неполном созревании спермиев. Данные электронной микроскопии еще раз говорят о том, что о качестве эякулята нельзя судить только по количественным показателям, игнорируя сложные морфолого-физиологические изменения, которые подчас обнаруживаются при углубленном исследовании.
Нельзя не согласиться с утверждением Joel (1954), Bodnar (1961) о том, что электронная микроскопия, дающая возможность ознакомиться с морфологией спермиев, все же не позволяет судить об оплодотворяющей способности эякулята. Проведенные с помощью электронного микроскопа исследования значительно расширили знания о морфологии спермиев, но они требуют длительной специальной подготовки биологического материала. Сперму разбавляют 2% раствором питьевой соды и оставляют на 2—3 часа для растворения слизи, затем центрифугируют с малой скоростью, отмывают дистиллированной водой, высушивают на экране и помещают в вакуумную камеру. Такая длительная подготовка материала занимает много времени и вряд ли может быть приемлема в практической деятельности лечащих врачей. Кроме того, электронная микроскопия не выявляет движения спермиев. С ее помощью нельзя установить их биологическое состояние.
Среди современных методов исследования морфофункциональных свойств живых клеток, по мнению В. П. Коваль (1965), значительное преимущество имеет люминесцентная и аноптральная микроскопия.
Явление люминесценции при микроскопических исследованиях впервые обнаружил Kohler (1904). Позже автор занялся специальным изучением феномена люминесценции и в 1908 г. создал первый микроскоп для люминесцентной микроскопии. Люминесценция — это излучение веществами или объектом наблюдения света за счет ранее поглощенной энергии. Различают первичную и вторичную люминесценцию. Первичной называют собственную люминесценцию ничем не окрашенного и не обработанного объекта. Свечение, появляющееся после обработки объекта исследования специальными органическими красками, называется вторичной люминесценцией.
Kilbel (1947), В. М. Бергольц (1953), М. Н. Мейсель (1958), В. П. Коваль (1965) и др. считают, что прижизненная люминесцентная микроскопия дает возможность изучить морфологию, физиологию и патологию живых клеток, не выявляемые при обычной микроскопии. Идентичное мнение высказывают Е. Гасуль и А. Жолкевич (1927), Hagemann (1938), С. Levaditti (1939), J. Levaditti (1941) Strugger (1938—1949), Енчев (1965) и др. Duijn (1954), пришел к выводу о флюоресценции разными цветами спермиев человека в зависимости от их жизнеспособности.
Этот вывод автора и по настоящее время является рабочей теорией при исследовании свежих препаратов семенной жидкости.
Люминесцентная микроскопия обычно производится после флюорохромирования капли спермы акридином оранжевым, разведенным физиологическим раствором в соотношении 1:20 000. Свободно проникая в ядра клеток, краситель накапливается в них и вызывает прижизненное структурирование ядерного вещества. В зависимости от биологического состояния спермии светятся под люминесцентным микроскопом зеленым или красным цветом. Нормальные семенные нити имеют ярко-зеленое свечение на темно-синем поле зрения. Головки их в горизонтальной плоскости имеют овальную форму и разную интенсивность свечения передней и задней части: передняя— более темная, а задняя — более светлая. Кроме подвижных, встречаются неподвижные, мертвые спермии, светящиеся красным цветом. Однако семенных нитей с красным свечением в свежем эякуляте бывает мало даже в случаях, когда имеется большое количество неподвижных спермиев.
В 1953 г. американский исследователь Wilska предложил новый метод световой микроскопии. В 1954 г. была опубликована его статья об устройстве этого типа микроскопа, названного им аноптральным. В августе 1955 г. М. А. Пешковым был изготовлен собственный аноптральный микроскоп, с помощью которого автор провел серию научных исследований. М. А. Пешков пришел к выводу, что картины, наблюдаемые при этом виде микроскопии, значительно превосходят по контрастности те, которые мы видим при фазово-контрастной микроскопии. Предложенный метод дает возможность различать многочисленные детали объекта, причем сохраняется резкое очертание исследуемых клеток.
Большое число наблюдений спермиев с помощью люминесцентной и аноптральной микроскопии провела В. П. Коваль (1964). С помощью этих методов наиболее полно выявляются морфофункциональные и биологические свойства семенных нитей при различных состояниях спермиогенеза. Исследование живых, но неподвижных спермиев человека люминесцентным или аноптральным микроскопами помогает в некоторых случаях установить нарушение спермиогенеза как причину бесплодного брака. Степень этого нарушения, а в ряде случаев и локализация патологического процесса также могут быть определены этими методами.