Методика подсчета семенных нитей у большинства авторов одинакова. Количество спермиев определяют в любой счетной камере (Бюркера, Горяева, Предтеченского, Тома, Нейбауэра и др.). Счет ведут по типу подсчета эритроцитов (Kiihnelt, 1953). Чаще же разведение производят в лейкоцитарных меланжерах, т. е. в 20 раз, а подсчет — по типу счета эритроцитов.
А. А. Шорохова (1959) при исследовании сперму не разводит, М. Н. Побединский (1949) для разведения рекомендует воду, Kuhnelt (1953)—дистиллированную воду, А. Э. Мандельштам (1959)—5% раствор соды с добавлением 1 мл формалина на 100 мл дистиллированной воды. Последний разбавитель является лучшим, так как быстро убивает спермин, делая их неподвижными, после чего исследование становится более легким.
Р. А. Черток (1927), Я. С. Дубинчик (1940), С. К. Лесной с соавторами (1958) считают возможным судить о количестве семенных нитей не по подсчету их в определенном объеме эякулята, а по густоте последних в поле зрения микроскопа. Так, Я. С. Дубинчик в зависимости от количества семенных нитей разделяет сперму на густую, средней густоты, редкую и сперму, в которой совершенно не обнаруживаются семенные нити.
М. Н. Остапенко и Г. Т. Гайворонский (1960) применили фотоэлектроколориметр для определения концентрации спермиев. Этот метод основан на том, что с изменением количества семенных нитей изменяется и цвет эякулята. Данной методикой пользуются в своей практике животноводы, которые имеют дело со значительным объемом эякулята. Мы проверили возможность применения фотоколориметрического определения концентрации семенных нитей при обследовании спермы мужчин, состоящих в бесплодном браке. Оказалось, что данный метод нельзя рекомендовать по ряду причин. Во-первых, при исследовании часто приходится встречаться с эякулятами малого объема (от 0,5 мл и менее), а по методике необходимо иметь 10 мл, разбавлять же эякулят довольно трудно. Во-вторых, при патологии спермы цвет ее часто зависит от присутствия лейкоцитов или эритроцитов, в результате чего ответ на вопрос о концентрации семенных нитей может быть ложным.
Для определения морфологии спермиев большинство авторов предлагают пользоваться окрашенными препаратами. Следует отметить, что распознавание патологических форм зависит от многих технических факторов и опыта исследователя. В практической работе важно не только подсчитать количество дегенеративных спермиев, но и перечислить сами формы.
Для окраски мазков спермы применяются различные способы. Один из них предложил Monch (1927). На предметном стекле делают мазок спермы. После высушивания его фиксируют проведением через пламя и помещают на 0,5—1 минуту в раствор Дакена. Затем мазок окрашивают следующим составом: 10 частей карболового фуксина Циля—Нильсена, 5 частей концентрированного раствора эозина и 5 частей 95° спирта. Для контрастности препарат докрашивают метиленовой синью в течение 2—3 минут. В мазке просматривают 300 клеток и выводят процент дегенеративных форм.
К. В. Калмыков и Б. М. Вярвильский (1937) для окраски мазков используют азур II и эозин в водном растворе.
Л. Т. Морголина (1940) мазок для исследования морфологии спермиев высушивает на воздухе и фиксирует пламенем. Затем наливает на него на несколько секунд 1% раствор хлорамина для удаления слизи, промывает водой и 95° спиртом. Мазок окрашивает в течение 2—5 минут смесью фуксина с эозином следующего состава: 2 части карболового фуксина Циля, 1 часть насыщенного спиртового раствора эозина, 1 часть 95° спирта. Затем мазок промывает водой, прокрашивает синью Леффлера и исследуют с помощью иммерсионной системы. Для определения дегенеративных форм автор рекомендует подсчитывать 400—600 спермиев.
Isenberg (1948) предложил упрощенную методику окраски спермы, при которой 5% бикарбонат натрия смешивают с эякулятом из расчета 1:1, после центрифугирования делают мазок, высушивают и фиксируют пламенем. Препарат докрашивают 3% раствором карболового фуксина в течение 3 минут, а после смывания водой — 2—3 минуты метиленовой синью.
Е. П. Майзель (1952) предлагает производить окраску мазков по одному из следующих методов: 1) гематоксилином в течение 15—20 минут, после чего мазок смывают водой и дополнительно красят эозином, вновь смывают водой, 2 раза спиртом и высушивают на воздухе; 2) толуидиновым синим 8—10 минут; 3) фуксином Вейгерта 3—4 минуты; 4) эозин-азуром 5 минут; 5) суданом III 10—15 минут, затем дополнительно гематоксилином 15—20 минут; 6) метиленовым синим 10— 15 минут.
В практической работе Е. П. Майзель использовал последний либо первый метод, что позволяло довольно детально изучать форму спермиев. Прокрашивание гематоксилин-эозином дает возможность получить ясную окраску ядер в головке семенных нитей. При этом сами спермин не изменяются, в то время как при других методах окраски нередко наблюдается разрушение головок или их деформация.
По методике П. Я- Герке (1956) густое, но не вязкое семя разводят равным количеством рингеровского раствора или другой изотонической жидкостью. Сперму фиксируют в капле 2% раствором осмиевой кислоты на часовом стекле в течение 5 минут. Затем мазок эякулята коагулируют орошением стекла жидкостью Шаудина в течение 1 минуты. После фиксации препарат ополаскивают в йодалкоголе, отмывают в течение 10 минут в проточной воде, красят гематоксилином Деляфильда, докрашивают водным или спиртовым раствором эозина, обезвоживают и заделывают под покровное стекло. Мазок исследуют с помощью иммерсионного объектива.
Scherold (1957) предлагает красить мазки гемалаун-эозином. Эякулят равномерно размазывают на предметном стекле и высушивают на воздухе. Фиксируют в течение 5 минут метиловым спиртом, затем 2 минуты 95, 80 и 70° этиловым спиртом, промывают водой. Мазок красят в течение 5 минут раствором 5% кислого гемалауна и отмывают в течение 30 минут в проточной воде. Далее следует окраска в течение 2 минут 10% спиртовым раствором эозина (контрастное окрашивание), затем обработка 70, 90 и 100% спиртовым раствором и, наконец, восходящим карбол-ксилолом. Мазок накрывают покровным стеклом и заделывают канадским бальзамом.
Boeminghaus и Klosterhalfen (1958) для исследования морфологии спермиев предложили следующий метод. Смешивают со спермой (1: 1) 2% раствор сульфата алюминия, затем после 3-минутного помешивания помещают в метиловый алкоголь, красят 20 минут краской Мейера, промывают водой и после 2-минутного выдерживания в спиртовом растворе эозина смывают спиртом.
Существует ряд методик окраски мазков спермы (Manson, Hynie, Walle и др.), не нашедших широкого применения в практике. В последние годы появились работы по исследованию морфологии спермиев при помощи фазово-контрастного, люминесцентного и электронного микроскопов, о чем подробно сказано в следующих разделах.
Приведенные здесь методики довольно трудоемки, в связи с чем большинство исследователей дают заключение об эякуляте без определения морфологии спермиев.
В 1959 г. А. А. Рубенковым для животноводов была предложена оригинальная методика одновременного подсчета общего числа спермиев и процента патологических форм. Методика Рубенкова является наиболее простой и может быть использована в повседневной практике лабораторий для подсчета общего числа спермиев, процента патологических форм и определения концентрации семенных нитей в эякуляте. Для окраски семенных нитей предлагается следующий состав: фуксина основного 0,1 г, азур-эозина по Гимзе (азура II 0,8 г, эозина Зг) 0,02 г, карболовой кристаллической кислоты 0,2 г; глицерина чистого 0,1 г, спирта-ректификата 96% 2 мл; 1% раствора химически чистого хлористого натрия на дистиллированной воде 100 мл.
Техника приготовления краски следующая. Отвешенные порошкообразные краски и карболовую кислоту тщательно растирают в маленькой ступке, затем добавляют глицерин и продолжают растирание, после чего приливают и хорошо смешивают спирт. Далее дробными дозами (для лучшего смывания краски со стенок ступки) по 10—15 мл при помешивании добавляют раствор хлористого натрия и выливают краску в стеклянный сосуд. Склянку закрывают пробкой и на 24 часа помещают в термостат при температуре 35—37°. Спустя сутки краску фильтруют в другую чистую стеклянную посуду через двойной слой фильтровальной бумаги. Приготовленный таким образом краситель может храниться при комнатной температуре длительное время. Для того чтобы не загрязнять краску, не следует производить зарядку меланжеров непосредственно из общей склянки.
Техника окрашивания спермиев такова. Перед началом работы необходимое количество краски переливают в чистую посуду. В чистые сухие лейкоцитарные смесители (комнатной температуры) набирают эякулят из середины массы (не следует брать пену) до метки 0,5. Смеситель вытирают ватой, конец его опускают в склянку с отлитой для данного исследования краской и набирают краситель до метки 11. При этом все спермин прекращают движение, окрашиваются и уже через 5 минут пригодны для подсчета. Заряженные смесители располагают на столе в горизонтальном положении.
Счетную камеру заряжают в обычном порядке: притирают покровное шлифованное стекло и под него подпускают небольшую каплю материала из меланжера. Во всех случаях перед зарядкой камеры содержимое смесителя тщательно перемешивают путем колебательных и круговых движений в течение 2 минут, затем из меланжера выпускают две капли жидкости и только третью каплю используют для зарядки камеры. Зарядку производят непосредственно на столике микроскопа при его горизонтальном положении и затем в течение 2 минут оставляют в покое для равномерного оседания спермиев. Подсчет семенных нитей ведут при увеличении в 400 раз (объектив 40, окуляр 10) при слегка открытой диафрагме и выбранной контрастности. Лучше всего вести наблюдение при освещении через матовое стекло. Отчетливо видны окрашенные спермии и сетка камеры.
Ядро головки окрашивается в синий цвет, а остальные части спермия — в розовый. Подсчет всех форм семенных нитей производят в 5 больших квадратах, разделенных на 16 маленьких. При этом 4 квадрата выбирают по диагонали камеры и один в стороне (удобнее в правом нижнем углу), т. е. подсчет ведут по тину счета эритроцитов при разбавлении материала в лейкоцитарном смесителе. Точность данных достигается правильным набором спермы в смеситель, горизонтальным положением стола микроскопа и подсчетом только тех спермиев, головки которых лежат в данном квадрате. Удобно пользоваться счетчиком для лейкоцитов крови, с помощью которого можно сразу же отмечать нормальные и патологические формы и суммировать их.
Если же счетчика нет, рекомендуется разграфить бумагу следующим образом:
| Квадраты | Общее число | |||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | ||
| Всего спермиев | ||||||
| Патология головки | ||||||
| Патология шейки—хвоста | ||||||
Сначала производят подсчет в одном большом квадрате (в 16 маленьких) всех спермиев, в том числе патологических. Результат записывают в первую клетку первой строки. Затем считают на той же площади отдельно спермии с патологией головки и заносят в первую клетку второй строки. После этого подсчитывают семенные нити с дегенеративными изменениями в области шейки — хвоста и записывают в первую клетку третьей строки. Так же поступают при подсчете в других 4 больших квадратах, после чего складывают полученные результаты по горизонтали. Подсчет занимает около 10 минут.
Полученное число и будет количеством (в миллионах) спермиев в 1 мл эякулята. Это видно из следующего расчета. Площадь камеры Гаряева равна 9 мм2, высота— 0,1 мм. Следовательно, объем равен 0,9 см3. Камера разделена на 225 больших квадратов. Подсчет спермий проводится в 5-ти больших квадратах. Объем их составляет (0,9: 225) Х5 = 0,02 мм3. В 1 мм3 семенных нитей будет в 50 раз больше, а в 1 см3 — еще в 1000 раз больше. Эякулят разводят в меланжере в 20 раз, поэтому, чтобы узнать число спермиев в 1 мл неразведенной спермы, количество семенных нитей, полученных при подсчете в 5-ти больших квадратах, следует умножить еще на 20. Другими словами, полученное число подсчитанных спермиев требуется умножить соответственно на 50, затем на 1000 и на 20, т. е. на 1 000 000.
После подсчета смеситель освобождают от содержимого, несколько раз промывают дистиллированной водой, затем эфиром. Если краска в смесителе находится долго, то, кроме промывания водой, его несколько раз следует вымыть 6—8% раствором уксусной кислоты или на несколько часов поместить в этот раствор, после чего промыть водой с эфиром. Смесители перед взятием пробы должны быть совершенно чистыми и сухими (шарик свободно перекатывается). Этого добиваются подсушиванием их в сушильном шкафу или над электроплиткой путем продувания воздуха с помощью резиновой груши.
Набирать эякулят во влажный или недостаточно очищенный (засоренный) смеситель нельзя, так как это может привести к большой ошибке при подсчете. Предлагаемый метод одновременного подсчета нормальных и патологических семенных нитей, а также их общего числа, прост, точен и объективен.
Данная методика использована нами с некоторыми изменениями. Эякулят мы разводили в лейкоцитарном смесителе, а не в эритроцитарном, как предлагал автор. Кроме патологии головки и хвоста по Рубенкову, определяли патологию шейки спермия. По описанной выше методике мы исследовали 1764 эякулята, полученных от 1060 мужчин, состоящих в бесплодном браке. Подсчет производили в двух сетках камеры и брали средний результат. Прежде чем рекомендовать данную методику для практического использования, мы произвели сравнительную оценку данных, полученных при определении морфологии спермиев по методике Рубенкова и при окраске мазков. Окраска производилась нами следующим образом. Эякулят стеклянной палочкой наносили на край предметного стекла, предварительно хорошо обезжиренного водой с мылом, а затем спиртом и эфиром. Краем покровного стекла делали тонкий мазок. После высыхания его фиксировали в течение 20 минут в абсолютном спирте пополам с эфиром. На 5 секунд мазок помещался в 1 % раствор хлорамина для удаления слизи, а затем смывали водой. Окрашивание производили по уже описанной нами методике Морголиной (1940).
Данные изучения морфологии семенных нитей, полученные в результате применения этих двух методик, лишь незначительно отличались друг от друга. Статистическая обработка показала их недостоверность. Колебание происходило в пределах вероятной ошибки. Однако методика Рубенкова является наиболее простой и может быть использована в повседневной практике лабораторий и для подсчета общего числа спермиев, процента патологических форм и определения концентрации семенных нитей в эякуляте. Необходимо отметить также, что, по-видимому, при подготовке мазка спермы (высушивание, фиксация и т. д.) происходит нарушение формы отдельных спермиев, что исключается при использовании методики Рубенкова.