Эстрогены (определение в моче по Брауну). Реактивы. Эфир, промытый насыщенным раствором сернокислого железа, дистиллированной водой и перегнанный. Петролейный эфир с точкой кипения 40—60°, перегнанный и насыщенный подои. Бензол химически чистый, перегнанный и насыщенный водой. Этиловый спирт, абсолютированный путем отстаивания с крупинками едкого натра и последующей двойной перегонкой. Борная кислота в порошке. Диметилсульфат, очищенный перегонкой. Концентрированный раствор Na2CO3 с рН 10,5, приготовленный путем добавления 150 мл 20%-ного NaOH к 1 л 8%-ного раствора NaHCO3. Окись алюминия для хроматографии II степени активности по Брокману, адсорбент дезактивируют добавлением 9—10% воды к исходной активности.
Реактивы для колориметрирования: для эстриола — 20 г хинона на 1 л 76%-ной серной кислоты; для эстрона — 20 г хинона на 1 л 66%-ной серной кислоты; для эстрадиола — 20 г хинона на 1 л 60%-ной серной кислоты.
Для лучшего растворения растворы подогревают и затем выдерживают-в течение 24 часов, хранят в темном месте.
Стандартные растворы эстрогенов и их метиловых эфиров, приготовленные путем метилирования кристаллических гормонов из расчета 5 мг эстрогена на 100 мл этанола.
Посуда, применяемая в опытах, не должна содержать следов хромовой кислоты.
Определение ведут из суточного количества мочи в двух параллельных пробах по 200 мл. Мочу нагревают до кипения в колбах с обратным холодильником и затем через холодильник прибавляют 30 мл концентрированной соляной кислоты. Кипятят в течение 1 часа и охлаждают колбу холодной водой. Охлажденную мочу переносят в делительную воронку и стероиды экстрагируют эфиром 1 раз по 200 мл, 2 раза по 100 мл. Эфирные экстракты объединяют и промывают 80 мл концентрированного раствора NaHCO3 (рН 10,5), который затем отбрасывают. К эфирному экстракту прибавляют сперва 20 мл 8%-ного NaOH и тщательно встряхивают, а затем 80 мл 8%-ного NaHCO3 и снова встряхивают. Водный слой тщательно отделяют от эфирного экстракта.
Эфирный экстракт переливают в колбу и выпаривают на водяной бане. Сухой остаток растворяют в 1 мл этанола, а так как эстриол плохо растворяется в бензоле, колбу помещают на холод. Затем в колбу наливают по 25 мл бензола и петролейного эфира, переносят бензольно-петролейный раствор в делительную воронку и экстрагируют из него сперва эстриол 2 раза по 25 мл воды, а затем эстрон с эстрадиолом 2 раза по 25 мл 1,6%-ного NaOH. Водные экстракты переносят в колбы, содержащие 0,9 г борной кислоты и 4 мл 20%-ного NaOH, а щелочные экстракты — в колбы, содержащие только 0,9 г борной кислоты. Обе колбы помещают в водяную баню с температурой 37°, в каждую добавляют по 1 мл диметилового сульфата. Диметилсульфат требует осторожного обращения и измеряется безопасной пипеткой. Колбы встряхиваются до тех пор, пока растворятся борная кислота с диметилсульфатом, и ставятся в водяную баню при 37° на 10—30 минут. Затем процедуру повторяют еще один раз, т. е. в ту же колбу прибавляют 1 мл диметилсульфата и оставляют в водяной бане при 37° на 20—30 минут, затем охлаждают и оставляют на ночь при комнатной температуре.
В каждую колбу прибавляют 10 мл 20%-ного NaOH и 2,5 мл 30%-ной перекиси водорода. Смеси переносят в делительные воронки, экстрагируют из них метилированную фракцию эстриола 25 мл бензола и метилированную фракцию эстрона с эстрадиолом 25 мл петролейиого эфира. Бензоловый и петролейный экстракты промывают 2 раза по 5 мл водой, которую затем тщательно удаляют.
Хроматографию метилированных эстрогенов проводят на стандартизованной окиси алюминия, 2 г которой засыпают в стеклянную трубку емкостью в 40 мл и внутренним диаметром 13 мм. Вверху трубка расширена в виде воронки, внизу она имеет стеклянное пористое дно, заканчивающееся конусом для присоединения приемника (колбы или пробирки). Скорость Движения раствора приблизительно равна одной капле в 2 секунды (с применением легкого отсасывания через боковой отросток, присоединенный к насосу).
Колонку для хроматографии готовят путем заполнения трубки бензолом (для эстриола) или петролейным эфиром (для эстрона и эстрадиола), в которые засыпают 2 г Al2O3, ждут равномерного осаждения и распределения окиси алюминия и на ее поверхность насыпают слой песка в 0,5 см, который заранее промывают кислотой, этанолом и водой. Растворители отсасывают до слоя песка, а затем в колонку с бензолом наливают метилированную фракцию эстриола в бензоле, а в колонку с петролейным эфиром наливают метилированную фракцию эстрона с эстрадиолом. Ожидают, пока уровень бензола и петролейного эфира опустится до песка, а затем элюируют из колонки метилированный эстриол, эстрон и эстрадиол. Для элюции метилированного эстриола в колонку сначала наливают 12 мл 1,4%-ного этанола в бензоле, эту фракцию выбрасывают, а затем 15 мл 2,5%-ного этанола в бензоле. Данная фракция содержит весь метилированный эстриол, ее собирают в пробирку. Метилированные эстрон с эстрадиолом из колонки элюируют следующими растворителями: 1) 12 мл смеси 25%-ного бензола в петролейном эфире, данную фракцию выбрасывают; 2) 15 мл смеси 40%-ного бензола в петролейном эфире, эта фракция содержит весь метилированный эстрон, ее собирают в пробирку; 3) 12 мл смеси 40%-ного бензола в петролейном эфире, элюат выбрасывают; 4) 12 мл бензола, элюат содержит весь метилированный эстрадиол. В пробирки, содержащие метилированные фракции эстриола, эстрона и эстрадиола, добавляют 0,2 мл 2%-ного раствора хинона в этаноле и маленькие кусочки пористой черепицы. Растворы выпаривают досуха на водяной бане или под вакуумом в струе азота. Параллельно проводят контрольный опыт, содержащий только раствор хинона.
К сухим остаткам эстрогенов прибавляют по 3 мл соответствующих реактивов хинона в серной кислоте. Растворы подогревают 20 минут в кипящей водяной бане (в первые 6 минут подогревания их дважды встряхивают). Затем пробирки охлаждают в холодной воде и добавляют воду: к пробам с эстриолом — 1 мл, с эстроном — 0,5 мл, с эстрадиолом — 0,2 мл. Пробирки встряхивают и снова подогревают в кипящей водяной бане 10 минут, затем охлаждают 10 минут и в спектрофотометре измеряют их оптическую плотность против оптической плотности контрольных проб. Измерение для эстриола и эстрона ведётся при 480, 516 и 552 миллимикрон, эстрадиола — при 480, 518, 556 миллимикрон. Оптическая плотность корригируется применением формулы Эллена, которую умножают на 2.
Эстрон и эстриол вычисляют по формуле
2 Д516 — (Д480 + Д552), эстрадиол корригируется по формуле
2 Д518 — (Д480 — Д556).
Окончательное количество метиловых эфиров эстрогенов вычисляют по калибрационной кривой, приготовленной на измерениях оптической плотности кристаллических метиловых эфиров эстрогенов. Это число затем превращается в соответствующее количество свободных эстрогенов умножением на соответствующие молекулярные веса с расчетом на суточное количество мочи.
Для хроматографии желательно брать стандартную окись алюминия II степени активности по Брокману, т. е. содержащую определенное количество воды (1—2% — 11 степень активности, до 10% — III степень, до 13% — IV степень, до 16% — V степень активности) и дезактивировать ее в лабораторных условиях. Браун рекомендует прибавлять 9,5 мг воды к 100 г Al2O3. Берут большую партию окиси алюминия, тщательно растирают ее с водой и встряхивают на аппарате для встряхивания до получения гомогенной массы. Для этого смесь можно слегка подогреть, потом охладить. Активность приготовленной Al2O3 следует проверять на 2-граммовой колонке, пропуская через нее 10 микрограммов метилированного кристаллического эстрона в 25 мл петролейного эфира. Элюцию производят смесью 25%-ного бензола в петролейном эфире. Если метилированная фракция эстрона появится в 16—20 мл элюата, то окись алюминия будет необходимой активности. Если окись алюминия слишком активна, т. е. метилированный эстрон не появляется в 16—20 мл элюата, то к ней необходимо добавить еще воды, пока активность не станет достаточной. Если метилированный эстрон появится в ранних порциях элюата, значит, окись алюминия недостаточно активная, слишком дезактивирована и в нее надо добавить небольшое количество исходной окиси алюминия.
С каждой новой порцией окиси алюминия рекомендуют также проделать опыт на фракционное разделение эстриола, эстрона и эстрадиола. При нужной активности окиси алюминия каждый из стероидов должен элюироваться соответствующим количеством и качеством растворителя. В противном случае надо экспериментально подбирать соответствующую активность, добавляя воду или исходный порошок окиси алюминия. Хранить откалиброванную окись алюминия следует в безвоздушных контейнерах и с целью предотвращения образования глыбок в процессе хранения ее время от времени встряхивать.
У здоровых менструирующих женщин количество эстрогенов в моче колеблется в зависимости от фазы менструального цикла. В начале цикла до 9—10-го дня сумма эстрогенов не превышает 10—15 γ (эстриол 6 γ, эстрон 5, эстрадиол 2 γ), затем к 11—14-му дню выделение эстрогенов достигает максимума 55—60 у (эстриол 27 γ, эстрон 20, эстрадиол 9 γ). Полагают, что этот пик соответствует овуляции. Затем экскреция эстрогенов снижается почти вдвое, а на 20-й день наступает второй подъем 40—45 у (эстриол 22 γ, эстрон 14, эстрадиол 7 γ), который расценивается как результат инкреторной деятельности желтого тела. У женщин в период менопаузы суточное выделение эстрогенов идет главным образом за счет эстрона и эстриола. При беременности количество экскретированных эстрогенов значительно возрастает и может достигать нескольких тысяч в последние месяцы беременности. У мужчин за сутки выделяется до 10 γ эстрогенов, преимущественно за счет эстрона и эстриола.
Методика Джейла и Крепи в модификации Л. Г. Лейбсона. 400 мл мочи, взятой из суточного количества, нагревают в колбе с обратным холодильником почти до кипения, после чего к ней прибавляют 60 мл концентрированной соляной кислоты, 6 мл фосфорно-вольфрамовой кислоты и кипятят в течение 1 часа. По окончании гидролиза раствор охлаждают на льду 2—3 часа и фильтруют. Осадок промывают 2 раза 5—10 мл дистиллированной воды.
Экстракцию эфиром производят в двух колонках типа Джейла и Крепи, но другого размера. В первую колонку через боковую воронку наливают 325 мл эфира. Профильтрованную мочу наливают в верхнюю воронку и пропускают через эфир 4 раза, после чего мочу сливают. Эфир промывают 2 раза 100 мл 9%-ного углекислого натрия (каждая порция пропускается через эфир дважды). Раствор углекислого натрия удаляют. Эстрогены экстрагируют 100 мл 1 н. раствора едкого натра, который пропускают через эфир дважды. Эфир промывают 50 мл воды (дважды). Промывная вида добавляется к щелочи. Прибавляют 16—17 мл концентрированной соляной кислоты, разбавленной в 2 раза, доводя раствор приблизительно до рН 4 (посинение бумажки конго). К раствору прибавляют 1 г двууглекислого натрия.
Раствор реэкстрагируют в той же колонке, тем же эфиром 4 раза. Эфир промывают 50 мл воды (дважды), сливают в колбу Вюрца и отгоняют досуха. Сухой остаток растворяют в 40 мл бензола. Раствор выливают в делительную воронку (объемом 125—200 мл), экстрагируют 4 раза 20 мл 1 н. раствора едкого натра и промывают двумя порциями воды (по 20 мл), которые прибавляют к щелочи. Раствор нейтрализуют соляной кислотой, разбавленной водой в 2 раза (примерно 15 мл), до посинения бумажки конго.
Раствор вновь экстрагируют эфиром (125 мл) во второй колонке, для чего пропускают через эфир 4 раза. Последний промывают двумя порциями 9%-ного раствора углекислого натрия (по 50 мл) и 50 мл воды (дважды); затем отгоняют в колбе Вюрца досуха. Остаток влаги удаляют с помощью водоструйного насоса. Сухой остаток сохраняют для колориметрического определения.