Данные о синтезе структурных белков и гемоглобина в ядерных эритроидных клетках при хронической почечной недостаточности противоречивы. Thorup и др. (1958) показали, что в условиях развития острой экспериментальной уремии скорость включения 59Fe в ядерные элементы эритропоэза in vitro в 2—3 раза ниже, нежели в норме. Erslev и Hughes (1960) обнаружили угнетающее влияние сыворотки кроликов после билатеральной нефрэктомии на утилизацию культурой клеток костного мозга здоровых животных. Эти работы легли в основу современных представлений о характере метаболизма железа и синтеза гемоглобина при уремии. Однако Markson и Moor (1962) в условиях инкубации in vitro не выявили угнетающего влияния уремической сыворотки на костный мозг больных ХПН и здоровых лиц по данным включения в ядерные элементы эритропоэза 355-метионина, 14С-2-глицина и 59Fe. Синтез гемоглобина, по мнению Markson и Moor (1962), при ХПН не угнетался.
Lamperi и др. (1974) определяли скорость включения 59Fe в нормобласты в процессе суточного переживания костного мозга уремичных больных вне организма. В контрольной группе лиц за 24 ч инкубации, нормобласт поглощал в среднем 14,9±4,2 мкг Х 10—9 59Fe. У больных с уремией, находящихся на консервативной терапии, включение снижалось до 5,3±1,1 мкг, что равнозначно данным, полученным у больных с гипопластической анемией (6,8±0,4 мкг Х 10—9/кл). При лечении больных с помощью гемодиализа включение возросло до 10,4±1,08 мкг. Авторы обнаружили, что угнетающее влияние на утилизацию 59Fe нормобластами оказывает метилгуанидин, однако более тонкий механизм этих изменений остался до конца не изучен. Обращает на себя внимание тот факт, что в исследованиях Lamperi и др. (1974) утилизация 59Fe средним нормобластом на клетку в час составляет 0,66 мкг Х 10—9. Эта величина примерно в 3 раза ниже общепринятых величин (С. И. Рябов и Г. Д. Шостка, 1974). Отсюда можно заключить о наличии выраженного внутрикультурального гемолиза, что ставит под сомнение результаты исследований.
Нами изучено включение 59Fe в культурах костного мозга у шести больных, страдающих хроническим диффузным гломерулонефритом со II и III ст. ХПН. Расчет производился в 3-часовых культурах без коррекции на ретикулоциты. В среднем нормобласт поглощал 1,49±0,2 мкг Х 10—9/кл/ч железа с колебаниями показателя от 0,30 до 2,89 мкг. Эта величина не отличалась от показателей нормы (1,83±0,18 мкг).
Для уточнения характера включения 59Fe в нормобласты различной стадии зрелости производилась авторадиография
мазков костного Мозга, приготовленных после 3- и 24-часовой инкубации клеток в присутствии изотопа. Выводился средний показатель включения (СГ1В) 59Fe в ядерные эритроидные предшественники с учетом степени их дифференциации. Всего обследовано 43 больных, страдающих хроническим гломеруло- и пиелонефритом с различной степенью выраженности ХПН. На рис. 55 представлены данные определения СПВ для пронормобластов, базофильных и полихроматофильных нормобластов после 3-часовой инкубации костного мозга с радиоактивным железом. Из графика следует, что у больных с различной степенью выраженности ХПН утилизация 59Fe эритроидными предшественниками по сравнению с нормой не снижается. Отмечено заметное повышение СПВ среди пронормобластов у больных с третьей степенью ХПН. Показатели для больных гломеруло- и пиелонефритом составили 0,55+0,1 и 0,55±0,02, соответственно. У больных с первой степенью ХПН величины СПВ для пронормобластов оставались в пределах нормы, составляя 0,41 ±0,03, при гломеруло- и 0,37±0,08 при пиелонефрите. Включение 59Fe в базофильные и полихроматофильные нормобласты также не отличалось от нормальных величин.
Рис. 55. Средний показатель включения (СПВ) 69Fe в пронормобласты (ПРО), базофильные нормобласты (Б), полихроматофильные большие (П. б) и средние (П. с) нормобласты после 3-часовой инкубации in vitro костного мозга больных хроническим гломерулонефритом с I ст. ХПН (1) и III ст. ХПН (2); больных хроническим пиелонефритом с I ст. ХПН (3) и III ст. ХПН (4) и здоровых лиц (5).
Рис. 56. Средний показатель включения 59Fe в эритроидные клетки различной стадии зрелости у здоровых лиц и больных с хроническими заболеваниями почек. Обозначения те же, что и на рис. 55.
В суточных культурах костного мозга (рис. 56) у больных хроническим пиелонефритом с достаточной функцией почек заметно повысилось включение 59Fe в ядерные эритроидные предшественники всех стадий зрелости. Так, СПВ для пронормобластов составил 0,8±0,09; базофильных нормобластов — 0,59±0,18; больших полихроматофильных — 0,38±0,06 и средних полихроматофильных нормобластов 0,1±0,002. С развитием уремии у больных с пиелонефритом выявлено снижение включения железа в нормобласты (соответственно СПВ составил: 0,62±0,14; 0,42±0,09; 0,37±0,08; 0,24±0,05; 0,08±0,01). Включение 59Fe в ядерные элементы эритропоэза при гломерулонефрите с I ст. ХПН оставалось ниже, нежели при пиелонефрите. Однако различия были статистически достоверными только для пронормобластов, базофильных и больших полихроматофильных нормобластов. В более зрелых клетках захват радиоактивного железа не зависел от степени выраженности азотемии и этиологии заболевания почек, находясь в пределах колебания нормальных величин.
Таким образом, согласно данным авторадиографических исследований можно придти к выводу, что при хронических заболеваниях почек включение 59Fe в нормобласты не снижается по сравнению с нормальными величинами. В уремической стадии заболевания нет различий во включении изотопа от этиологии поражения почек. На начальных этапах развития хронического пиелонефрита выявлено достоверное повышение захвата 59Fe способными к пролиферации нормобластами. У больных с хроническим гломерулонефритом и выраженной азотемией включение 59Fe в ядерные эритроидные клетки при суточной инкубации костного мозга оставалось таким же, как и в 3-часовых культурах, т. е. не было отмечено прироста радиоактивности по мере удлинения срока инкубации. Это обстоятельство позволяет говорить о своеобразии внутриклеточного метаболизма железа у больных в терминальной стадии хронического гломерулонефрита.
Не все железо, поглощенное клеткой, используется для синтеза гемоглобина. Часть его остается в нормобластах в виде глыбок ферритина. Чтобы изучить характер перемещения железа в нормобластах при ХПН, наряду с авторадиографическими исследованиями, мы изучали парциальные сидеробластограммы до инкубации костного мозга, после 3-часового и суточного переживания клеток вне организма в присутствии железа. Парциальные сидеробластограммы сосчитаны у 65 больных хроническим гломерулонефритом и 20 больных пиелонефритом.
У здоровых лиц по мере удлинения срока инкубации содержание сидеробластов снижается с 22% ДО 13%. Равномерно уменьшается количество сидеробластов I типа (1—2 гранулы в нормобласте), а число клеток III типа (более 6 гранул в нормобласте) изменяется мало. Динамика парциальных сидеробластограмм у больных с хроническим гломеруло- и пиелонефритом представлена на рис. 57.
Рис. 57. Парциальные сидеробластограммы у больных хроническим гломерулонефритом (А) и пиелонефритом (Б).
Представлены кривые распределения типов сидеробластов до инкубации (1), через 3 ч (2) и 24 ч (3) переживания костного мозга вне организма. Весь столбец отражает общее количество сидеробластов у больных с 1 ст. ХПН, темная часть у лиц с III ст. ХПН.
Из рисунка следует, что при гломерулонефрите с I ст. ХПН исходное содержание сидеробластов (16%) через 3 ч инкубации снижается до 6% и остается таким же к концу суточного культивирования. При этом количество сидеробластов I типа уменьшается с 13 % до 4—5%. У больных с III ст. ХПН исходный уровень сидеробластов составил 10%. К концу инкубации он снизился до 5%. Превалировали сидеробласты I типа. III тип клеток не превышал 0,5%.
У больных хроническим пиелонефритом с I ст. ХПН исходное содержание сидеробластов с 22% по мере культивирования костного мозга уменьшилось до 7%. Так же, как и при гломерулонефрите, у этих лиц превалировали клетки I типа. При III ст. ХПН обнаружено снижение исходного содержания сидеробластов (13%). В процессе переживания костного мозга их число постепенно падало до 3%.
Следовательно, по мере культивирования костного мозга больных нефритами снижается процентное содержание сидеробластов. У больных с выраженной азотемией исходное количество сидеробластов заметно ниже, а в ходе инкубации идет дальнейшее снижение их числа.
Рассматривая метаболизм внутриклеточного железа при ХПН, можно прийти к выводу, что уремия не угнетает поступление железа в нормобласты, а попавшее в клетку железо активно утилизируется при синтезе гема. Так, даже при III ст. ХПН количество сидеробластов по мере удлинения срока инкубации неуклонно снижается. Исследования метаболизма железа при ХПН позволяют сделать предположение о возможном поступлении железа в нормобласты из разрушающихся молекул гемоглобина (внутрикостномозговой гемолиз), так как иначе трудно объяснить достаточно высокое содержание сидеробластов, несмотря на относительно низкий уровень транспортного железа сыворотки. У больных пиелонефритом имеются особенности обмена внутриклеточного железа, связанные, очевидно, с влиянием хронической инфекции.
Важным критерием для суждения о функциональной активности клеток костного мозга является оценка их способности к синтезу нуклеиновых кислот. Представление об активности синтеза ДНК можно составить по данным включения 3Н-тими-дина. Полученные при этом данные приводились выше. С целью изучения синтеза РНК в культуры костного мозга больных хроническим гломерулонефритом вносили 3Н-уридин. О величине захвата изотопа ядерными элементами эритропоэза в ходе 3-часовой инкубации судили после авторадиографической обработки материала. Подсчитывались процент меченых клеток и СПВ для популяций элементов, находящихся на разных уровнях созревания.
Всего обследовано 26 больных с различной степенью выраженности почечной недостаточности (таблица 79).
Таблица 79. Интенсивность включения 3Н-уридина в ядерные эритроидные клетки после 3-часовой инкубации костного мозга вне организма (M±m)
| Группы обследованных лиц | Число лиц в группе | Пронормобласты | Базофильные нормобласты | Полихроматофильные нормобласты | ||||||||
| индекс метки (%) | СПВ | индекс метки (%) | СПВ | большие | средние | малые | ||||||
| индекс метки (%) | СПВ | индекс метки (%) | СПВ | индекс метки (S4) | СПВ | |||||||
| Здоровые | 6 | 87±1,9 | 2,24±0,14 | 80±2,3 | 1,80±0,09 | 65±2,4 | 1,22±0,1 | 34±3,5 | 0,45±0,06 | 12±1,3 | 0,12+0,01 | |
| Хронический гломерулонефрит | ХПН
I ст. |
9 | 88±1,6 | 1,72±0,09 | 86±2,4 | 1,46±0,09 | 61±2,2 | 0,78±0,05 | 37+7,4 | 0,32±0,01 | И±1,4 | 0,11±0,01 |
| ХПН
II ст. |
10 | 82±1,5 | 1,50±0,06 | 77±2,8 | 1,24±0,07 | 57±1,9 | 0,79±0,04 | 27±2,0 | 0,30±0,02 | 13,1±1,2 | 0,14+0,01 | |
| ХПН
III ст. |
7 | 82±1,7 | 1,70±0,12 | 81±1,8 | 1,23±0,09 | 59±2,8 | 0,84±0,07 | 24±3,0 | 0,25±0,03 | 12±2„8 | ал 2±0,03 | |
Как видно из таблицы, индексы метки нормобластов при ХПН остаются такими же, как и у здоровых лиц. Снижение индексов метки отмечено только при III ст. ХПН для средних полихроматофильных нормобластов. Однако интенсивность метки отдельно взятых клеток при ХПН снижается. Достоверное уменьшение СПВ по сравнению с нормой при I ст. ХПН отмечено для пронормобластов (Р<0,01), базофильных нормобластов (Р<0,01), больших и средних полихроматофильных нормобластов (Р<0,01). По мере прогрессирования азотемии величины СПВ почти не снижались. В малых полихроматофильных нормобластах никаких характерных изменений отмечено не было.
Таким образом, при хронических заболеваниях почек нарушение синтеза РНК, по данным авторадиографии с 3Н-уридином, наступает еще в доазотемической стадии процесса. Сама по себе уремия приводит к уменьшению индексов метки и СПВ в группе средних полихроматофильных нормобластов, составляющих примерно 40—50% всех ядерных эритроидных клеток. Эти данные дают право предположить наличие угнетающего влияния уремии на метаболизм уридина, а следовательно, и РНК в эритроидных клетках.
Об активности образования гемоглобина при ХПН можно судить по интенсивности включения 3Н-глицина в нормобласты, так как эта аминокислота включается в гемоглобин. 3Н-глицин добавлялся к культуре костного мозга 12 здоровых лиц и 28 больных хроническим гломерулонефритом. Срок инкубации— 3 ч. Активность накопления изотопа в клетках выявлялась авторадиографически. Рассчитывались индексы метки и СПВ.
Данные об интенсивности включения 3Н-глицина в нормобласты различной стадии зрелости представлены в таблице 80.
Таблица 80. Индексы метка и средний показатель включения (СПВ)3H-глицина в нормобласты при 3-часовой инкубации клеток костного мозга исследуемых лиц в условиях in vitro (M±m)| Группы лиц | Число лиц в группе | Пронормобласты | Базофильные нормобласты | Полихроматофильные нормобласты | ||||||||
| индексы метки (X) | спв | индексы метки {%) | СПВ | большие | средние | малые | ||||||
| индексы метки | спв | индексы метки {%) | СПВ | индексы метки (%) | СПВ | |||||||
| Здоровые | 12 | 83,6=1=1,1 | 2,03±0,08 | 86,6±1,5 | 1,93±0,09 | 66,4±2,2 | 1,06±0,04 | 31,7±2,0 | 0,50±0,03 | 17,1±] ,3 | 0,22±0,02 | |
| Хронический гломерулонефрит | ХПН I ст. | 13 | 78,9±2,1 | 1,59±0,06 | 8Э,0±1,4 | 1,35±0,05 | 59,8±1,6 | 0,81±0,03 | 32,4±1,2 | 0,35±0,02 | 16,5±1,4 | 0,18±0,02 |
| ХПН II ст. | 7 | 75,4±2,2 | 1,38±0,08 | 80,7±3,4 | 1,ЗЭ±0,07 | 59,9±3,7 | 0,74±0,02 | 31,9±3,6 | 0,35±0,05 | 13,4±3,2 | 0,14±0,03 | |
| ХПН III ст. | 8 | 83,3±2,2 | 1,37±0,10 | 80,1±1,9 | 1,16±0,07 | 57,6±2,6 | 0,65±0,05 | 25,7±2,5 | 0,26±0,02 | 8,8±0,8 | 0,09±0,01 | |
Из таблицы следует, что снижение индексов метки базофильных нормобластов выявляется уже в I ст. ХПН и в дальнейшем по мере нарастания ХПН не прогрессирует. Аналогичные изменения отмечены и среди больших полихроматофильных нормобластов. В малых полихроматофильных нормобластах индексы метки снижаются по мере прогрессирования ХПН (при I ст. — 16,5+1,4%, при II ст. —8,8+0,8%).
В средних полихроматофильных нормобластах индексы метки заметно снижались лишь в терминальной фазе уремии, составив 25,7+2,5%.
Еще более отчетливое уменьшение включения 3Н-глицина в нормобласты выявлено при подсчете СПВ. Уже в I ст. ХПН средний показатель включения оказался сниженным для пронормобластов, базофильных больших и средних полихроматофильных нормобластов (различия с нормой статистически достоверные, Р<0,05). Во всех группах клеток при III ст. уремии СПВ достиг наиболее низких величин, указывая на то, что по мере прогрессирования ХПН включение 3Н-глицина в нормобласты снижается. Между СПВ в полихроматофильных нормобластах и мочевиной крови выявлена обратно пропорциональная зависимость (г ——0,67).
Исходя из данных авторадиографических исследований, с помощью 3Н-глицина можно высказать предположение о возможном нарушении синтеза гемоглобина в ядерных элементах эритропоэза по мере прогрессирования почечной недостаточности.
Этот процесс особенно заметен в группе средних полихроматофильных нормобластов, наиболее активно синтезирующих гемоглобин и составляющих половину всех ядерных эритроидных предшественников. В связи с этими наблюдениями особый интерес представляет определение абсолютных значений скорости синтеза гемоглобина при ХПН. С этой целью мы изучали состояние скорости синтеза белковой частицы молекулы гемоглобина, так как процесс образования глобина является первичным и в определенной мере лимитирующим при биосинтезе гемоглобина. Кроме того, при хроническом нефрите белковый обмен оказывается рано и значительно нарушенным.
Скорость синтеза глобина (ССГ) вычисляли, исходя из интенсивности включения 1,2-14С-глицина (1 мкКи/1 X 107 ядерных клеток) в изолированный глобин. После 4-часовой инкубации клеток в присутствии метчика методом ионообменной хроматографии выделяли гемоглобин, из которого подкисленным ацетоном преципитировали глобин. Содержание гемоглобина определяли цианметгемоглобиновым методом, концентрацию глобина — прямой спектрофотометрией. Счет активности (3-излучения производили на пропорциональном счетчике 2154-1-1М в геометрии 4л. Скорость синтеза глобина (ССГ) вычислялась в милиграммах на клетку в час. Помимо ССГ вычисляли скорость синтеза глобина нормобластами с учетом вклада, вносимого ретикулоцитами костномозговой суспензии (ССГР).
Контрольную группу I составили 8 гематологически здоровых лиц. В группе II было 14 больных хроническим гломерулонефритом без признаков ХПН и анемии. Основную группу III составили 12 больных хроническим гломерулонефритом II и III ст. ХПН. Клиренс эндогенного креатинина у них колебался от 3,6 до 40 мл/мин, креатинин сыворотки от 2,25 до 16,3 мг%. В целом по группе количество эритроцитов составило 2,87+±0,32 млн./мм3 и содержание гемоглобина 9,3± 1,01 г%.
Результаты определения скорости синтеза глобина в пересчете на усредненный нормобласт приведены в таблице 81.
Таблица 81. Скорость синтеза глобина при хроническом диффузном гломерулонефрите
| Скорость синтеза глобина | Группа | Достоверность различия между группами (Р) | ||||
| I | II | III | II и I | III и I | III и II | |
| ССГ ·10—10 мг/кл·ч | 4,53 | 4,13 | 2,00 | 0,50 | 7,56 | 4,99 |
| М±т | ±0,18 | ±0,60 | ±0,24 | (Р > 0,05) | (Р< 0,001) | (Р<0,01) |
| ССГР ·10—10 мг/кл·ч | 5,10 | 4,02 | 1,62 | 0,09 | 8,24 | 321 |
| М±m | ±0,23 | ±0,87 | ±0,20 | (Я > 0,05) | (Р < 0,001) | (Р <0,01) |
У больных хроническим гломерулонефритом без нарушения функции почек показатели ССГ и ССГР по сравнению со здоровыми лицами не изменялись, составив 4,13±0,10 X 10—10 мг/кл·ч и 4,02±8,7Х 10—10 мг/кл·ч, соответственно. При развитии ХПН отмечалось выраженное замедление синтеза глобина. Величина ССГ составила 2,00±0,24Х10—10 мг/кл·ч и ССГР — 1,62±0,20Х10—10 мг/кл·ч. Угнетение образования глобина происходило параллельно снижению клиренса эндогенного креатинина (r = +0,45; Р<0,01). Однако достоверная зависимость между ССГ и уровнем креатинина сыворотки отсутствовала (r=—0,32; Р >0,05). Не выявлено зависимости между скоростью синтеза глобина и уровнем гемоглобина крови (r= +0,25; Р>0,05).При уровне креатинина сыворотки в пределах 4,0 мг% устанавливалась низкая скорость синтеза глобина, и по мере дальнейшего прогрессирования уремии достоверного снижения синтеза не отмечалось (рис. 58).
Рис. 58. Зависимость скорости синтеза глобина (ССГ) от содержания креатинина сыворотки (Cr) и уровня гемоглобина (Hb).
I — скорость синтеза глобина, 2 — уровень гемоглобина.
Таким образом, снижение скорости синтеза глобина (гемоглобина) является ранним и значимым нарушением в системе эритрона. Взаимосвязь продукции гемоглобина с выраженностью признаков почечной недостаточности носит сложный характер. Немалую роль играют не только существующие в организме токсические продукты уремии, приводящие к гемолизу эритроидных клеток, в том числе и ядерных, но и адаптивные сдвиги, наступающие в эритроне и его стволовых предшественниках.