Вопросы пролиферации ядерных эритроидных клеток при хронической почечной недостаточности изучены поверхностно. Это связано с тем, что методики, используемые для определения величины и скорости размножения эритроидных предшественников, трудоемкие и не всегда приемлемы в клинике (С. И. Рябов, Г. Д. Шостка, 1973).
Параметрами пролиферации являются величины генерационного цикла клеток, определяемые с помощью 3Н-тимидина, митотические и статмокинетические индексы. Каждый из перечисленных выше методов исследования имеет свои преимущества и недостатки, поэтому важно определять параметры пролиферации одновременно несколькими способами.
При определении пролиферативной активности ядерных эритроидных предшественников при хронической почечной недостаточности нами изучались митотические индексы и способность клеток утилизировать 3Н-тимидин в условиях инкубации элементов in vitro. Кроме того, в холе культивации костного мозга вне организма исследовалась скорость обновления способных к делению нормобластов. С этой целью использовалась методика культивации с применением колхицина и радиоактивного железа (С. И. Рябов, Г. Д. Шостка, 1973). Скорость пролиферации эритроидных клеток выражалась в процентах прироста внутриклеточной радиоактивности в культурах, где деление клеток не останавливалось колхицином. Всего обследован 51 больной с различной степенью выраженности ХПН.
Согласно данным Воск и Thedering (1952), у больных, страдающих нефротическим синдромом с достаточной функцией почек, количество митотических фигур среди клеток костного мозга повышалось до 1,4% при норме 1%. При хроническом гломерулонефрите с умеренной почечной недостаточностью (креатининемия — 4,33 мг%) частота митозов возросла до 1,7%. При злокачественном нефросклерозе обнаружено 2,4% митозов. Однако общие митотические индексы не могут характеризовать пролиферативную способность нормобластов, так как их повышение может быть связано с активацией деления других ростков костного мозга.
Данные по исследованию митотической активности ядерных эритроидных предшественников при различной выраженности ХПН представлены на рис. 52. Общие митотические индексы эритроидных клеток рассчитывались на 1000 нормобластов всех стадий зрелости. Специфические митотические индексы высчитывались только для способных к делению ядерных элементов эритропоэза. Из рисунка следует, что общие митотические индексы нормобластов у больных с различной степенью выраженности хронической почечной недостаточности достоверно не отличались от показателей здоровых лиц, колеблясь от 23,0± 1,06% при первой степени почечной недостаточности до 23,9±1,08% при третьей. Однако специфические митотические индексы делящихся нормобластов по мере прогрессирования азотемии достоверно возрастали (Р<0,02). Так, у здоровых лиц они составили 33,3±1,37‰, при I степени ХПН — 35,6±1,4‰, при II —40,4±3,06%, а при III — 42,9±2,87‰. Прослеживалась четкая прямо пропорциональная зависимость частоты эритроидных митозов от процентного содержания эритроидных предшественников в миелограмме (r = +0,51; Р<0,02).
Рис. 52. Общие (светлые столбики) и специфические (заштрихованные) митотические индексы ядерных эритроидных клеток у здоровых лиц и у больных I, II и III степенью ХПН.
О. И. Моисеева и А. Я. Ярошевский (1969) сравнивали влияние сыворотки здоровых лиц и больных с ХПН на статмокинетические индексы эритроидных предшественников костного мозга кроликов при культивировании in vitro. При этом оказалось, что сыворотка здоровых лиц по сравнению с раствором Хенкса увеличивает показатели статмокинетических индексов. Наоборот, при заболеваниях почек в доазотемической стадии процесса и при выраженной ХПН сыворотки больных достоверно угнетают величины статмокинетических индексов (P<0,001). Тормозящее влияние сыворотки больных с хроническими заболеваниями почек на статмокинез не зависело от степени выраженности азотемии и анемии. Однако величина статмокинетических индексов при ХПН может отличаться от поведенческой реакции нормальных костномозговых клеток в ответ на уремическую сыворотку. Методика определения скорости пролиферации нормобластов в условиях in vitro фактически базируется на учете величины статмокинетических индексов, поскольку прирост внутриклеточной радиоактивности в культуре пролиферирующих клеток оценивается при сравнении с таковой, где деление нормобластов остановлено колхицином. Чем выше пролиферативная активность нормобластов, тем большей будет разница в содержании внутриклеточной радиоактивности между колхициновой и неколхициновой культурой. В качестве метчика необходимо избрать изотоп или меченую аминокислоту, которые включаются только в гемоглобин (например, радиоактивное железо).
Используя подобную методику, Erslev и Hughes (1960) показали, что сыворотки животных после билатеральной нефроэктомии снижают скорость пролиферации нормобластов костного мозга с 40+20% до 27+11%, т. е. получен эффект, аналогичный исследованиям О. И. Моисеевой и А. Я. Ярошевского (1969).
Однако при оценке скорости пролиферации нормобластов костного мозга больных уремией результаты оказались совершенно иными. Ядерные эритроидные предшественники костного мозга больных ХПН, инкубированные в собственной плазме, обладали высокой скоростью пролиферации (рис. 53). Так, у здоровых лиц темп пролиферации составил 26+2% в сутки. У больных хроническим гломерулонефритом с минимальными нарушениями экскреторной функции почек скорость обновления эритроидных клеток достоверно снизилась, составляя 16±2% (Р<0,05). При второй степени ХПН скорость пролиферации повысилась до 33+6%, а при третьей — до 54±10%, что достоверно выше показателей здоровых лиц (Р<0,001) и больных с начальной степенью почечной недостаточности (Р<0,001).
При хроническом пиелонефрите показатели скорости пролиферации нормобластов достоверно не отличались от нормальных величин независимо от степени ХПН (см. рис. 53). Следовательно, повышение скорости пролиферации нормобластов при уремии более характерно для больных гломерулонефритом. Эти данные свидетельствуют о том, что адекватные сдвиги эритропоэза при ХПН, с одной стороны, моделируются в зависимости от этиологии поражения почек, а с другой — связаны со степенью повреждения почечной паренхимы. Возможно, определенное влияние на скорость обновления эритроидных клеток у больных пиелонефритом оказывает инфекция, так как имеются указания на снижение пролиферации при хронических воспалениях. Скорость пролиферации нормобластов находится в обратно пропорциональной зависимости от количества эритроцитов (r = —0,45; Р < 0,05) и гемоглобина (r = —0,43; Р<С 0,05). Прослеживается умеренная связь темпа пролиферации со степенью азотемии (r=— 0,31; Р<0,05).
Рис. 53. Скорость пролиферации нормобластов при суточной инкубации in vitro костного мозга здоровых лиц (Л), больных хроническим гломерулонефритом (Б) и пиелонефритом (В). I, II и III степени ХПН.
Включение 3Н-тимидина, специфического предшественника ДНК, позволяет характеризовать пролиферативную активность способных к делению клеток путем исследования их генерационного цикла. Однако в условиях in vitro, если не используется синхронизированная культура клеток, величина захвата 3Н-тимидина клетками имеет относительную ценность, выявляя лишь потенциальную способность клеток к делению (С. И. Рябов, Г. Д. Шостка, 1973).
Kuroyanagi и Saito (1966) показали снижение индексов метки нормобластов 3Н-тимидином при культивировании костного мозга в уремической сыворотке кроликов после билатеральной нефрэктомии.
Markson и Morre (1962), производя аналогичные опыты, не смогли выявить различий во включении предшественников ДНК в эритроидные клетки при инкубации костного мозга как в нормальной, так и уремической сыворотке.
При исследовании костного мозга больных Г. Т. Каримова и В. Я. Плоткин (1971), Kuroyanagi (1961) обнаружили снижение процента меченных 3Н-тимидином нормобластов.
Данные по изучению интенсивности включения 3Н-тимидина в ядерные элементы эритропоэза костного мозга больных хроническим диффузным гломерулонефритом с различной степенью азотемии представлены в таблице 78. 3Н-тимидин (5 мкКи на 1 мл культуры) в течение 2 ч инкубировался с клетками костного мозга. Радиоактивность нормобластов выявлялась авторадиографически. Подсчитывались индексы метки и так называемый средний показатель включения (СПВ).
Таблица 78. Включение 3Н-тимидина в ядерные эритроидные клетки костного мозга больных хроническим диффузным гломерулонефритом с различной степенью выраженности ХПН (M±m)
| Степень ХПН | Число
лиц в группе |
Пронормобласты | Базофильные нормобласты | Поликроматофильные нормобласты | |||||
| индекс метки (%) | СПВ | индекс метки (%) | СПВ | большие | средние | ||||
| индекс метки (%) | СПВ | индекс метки (%) | СПВ | ||||||
| I | 10 | 80,7±1,8 | 1,924=0,09 | 77,2±2,2 | 1,58±0,18 | 57,2±1,7 | 0,82±0,04 | 23,1±2,3 | 0,26±0,03 |
| II | 11 | 79,1±1,6 | 1,90±0,05 | 75,2±2,0 | 1,42±0,08 | 51,0±2,1 | 0,83-НО,03 | 21,9±2,3 | 0,24±0,02 |
| III | 9 | 80,1±3,0 | 1,85±0,15 | 78,4±2,3 | 1,69±0,14 | 51,1±2,2 | 0,70+0,04 | 20,4±1,1 | 0,22+0,02 |
| Здоровые лица | 11 | 88,8±2,2 | 2,14±0,12 | 82,7±1,5 | 1,91±0,13 | 58,8±1,6 | 1,04±0,08 | 25,5±1,5 | 0,34±0,04 |
При инкубации костного мозга 10 больных I ст. ХПН метилось 80,7±1,8% пронормобластов; 77,2+2,2% базофильных нормобластов; 57,2±1,7% больших и 23,1 ±2,3% средних полихроматофильных нормобластов. Отмечено достоверное снижение меченых пронормобластов по сравнению с нормой (Р<0,05). В этой же группе больных выявлено снижение СПВ для пронормобластов (1,92±0,09), однако по сравнению с нормой различие оказалось достоверным для больших полихроматофильных нормобластов (0,82±0,04; Р<0,01). В костном мозге больных II ст. ХПН метилось 79,1 + 1,6% пронормобластов и 51,0±2,1% больших полихроматофильных нормобластов, что гораздо ниже величин, полученных у здоровых лиц (P<0,05). Индекс метки больших полихроматофильных нормобластов был снижен не только по сравнению с нормой, но и с аналогичным показателем больных I ст. ХПН (Р<0,02). Выявлено снижение СПВ в базофильных нормобластах (1,42+0,08; Р<0,01), больших (0,83±0,03; Р < 0,02) и средних (0,24± 0,02; Р < 0,02) полихроматофильных нормобластах.
При культивировании костного мозга больных с III ст. ХПН процент меченых пронормобластов составил 80,1±3,0%, базофильных нормобластов — 78,4±2,3%, больших полихроматофильных— 51,1±2,2% и средних полихроматофильных нормобластов — 20,4±1,1%. Снижение индексов метки было достоверным по сравнению с нормой для пронормобластов (Р<0,02), больших (Р<0,01) и средних (Р<0,01) полихроматофильных нормобластов. Существенное уменьшение СПВ отмечено в больших (P<0,01) и средних (Р<0,02) полихроматофильных нормобластах.
Таким образом, уже на ранних стадиях хронического гломерулонефрита с минимальными нарушениями экскреторной функции почек отмечено уменьшение индексов метки пронормобластов. По мере прогрессирования уремии снижаются индексы метки для полихроматофильных нормобластов. В группе больных с выраженной уремией интенсивность включения 3Н-тими-дина в пролиферирующие нормобласты существенно не отличается от такового по сравнению с больными с умеренно выраженной уремией или даже без нее.
Следовательно, у больных с почечной недостаточностью отмечается нарастание специфических митотических индексов и повышается скорость обновления эритрона в условиях инкубации клеток in vitro. В то же время число клеток, включающих 3Н-тимидин, а следовательно, и синтезирующих ДНК, снижается. При объяснении этих противоречий можно исходить из двух возможностей — увеличения массы ядросодержащих эритроидных клеток, о чем указывалось выше, а следовательно, и увеличении пролиферирующего пула или наличия новой неполноценной популяции нормобластов. Последнее предположение подтверждается при более детальном анализе данных, касающихся внутрикостномозгового гемолиза.
На основании приведенных сведений можно утверждать, что уже при I ст. ХПН происходят умеренные нарушения синтеза нуклеиновых кислот. В дальнейшем эти изменения прогрессируют. В качестве компенсаторного механизма следует расценивать появление новой популяции быстро пролиферирующих клеток, чем несколько замедляется прогрессирование малокровия и количество эритроцитов устанавливается на каком-то базальном уровне. Отмеченное увеличение массы активного костного мозга является следствием указанных пролиферативных изменений.