При испытании антирахитических свойств препарата оказалось, что 25-ГХК в 1,5 раза активнее витамина Д3. Он значительно сильнее стимулировал абсорбцию кальция (Ponchon, De Luca, 1969 и др.). Если витамин Д проявляет свое действие только через 10 ч, то 25-ГХК — через 4 ч после введения животным. Кроме того, в ядрах клеток слизистой тонкого кишечника 25-ГХК обусловил более быструю, чем витамин Д3, транскрипцию ДНК в РНК.
В опытах in vivo и in vitro (Ponchon, De Luca, 1969) установлено, что печень является единственным органом, в котором осуществляется окисление витамина Д3 (холекальциферола) в 25-гидроксихолекальциферол. Аналогичному превращению в печени подвергается эргокальциферол (витамин Д2) с образованием 25-гидроксиэргокаль-циферола. Антирахитическая активность этого метаболита так же, как и 25-ГХК, в 1,5 раза выше, чем исходного витамина Д2. В первые часы после введения витамин Д3 (или Д2) аккумулируется в печени, где под воздействием гидроксилазы присоединяется гидроксильная группа к углероду в положении 25 (боковой цепи молекулы витамина) с образованием 25-ГХК (Suda a. oth., 1969; рис. 2). Создавалось впечатление, что имеются веские основания считать 25-ГХК физиологически активной формой витамина Д3 в организме. Однако исследования Е. Kodicek а. oth. (1970) показали, что и этот метаболит в тканях претерпевает дальнейшие изменения. Так, после внутривенной инъекции меченного двойной меткой (Н3 и С14) витамина Д при детальном хроматографическом разделении неомыляемой фракции плазмы крови и тканей цыплят был выявлен метаболит витамина Д («пик Р»), более полярный, чем 25-ГХК. Причем оказалось, что предшественником в синтезе этой окисленной формы служил 25-ГХК. Установлено, что у этого вещества отношение Н3 и С14 ниже, чем у исходного витамина, за счет потери трития у углерода в положении 1 (кольцо А).
Рис. 2. Продукты окисления витамина Д2: I — кетон 250; II— кетон C19; III — С21-альдегид.
D. R. Fraser, Е. Kodicek (1970) сделали интересное сообщение. При инкубации гомогенатов различных органов и тканей (слизистой кишечника, почек, печени, костной ткани, мышц, тимуса и т. д.) только почки обладали способностью окислять 25-ГХК в более активную форму, что было подтверждено также в эксперименте in vivo. Введение 25-ГХК животным с удаленными почками не вызывало образования окисленной формы витамина Д3, в то время как у контрольных крыс эта форма обнаружилась. Таким образом, была доказана уникальная роль почек в процессе превращения 25-ГХК в более полярное соединение. В дальнейшем такая способность была использована для получения нового метаболита. Оказалось, что почечный гомогенат за один час инкубации окисляет более 15% добавленного в среду предшественника — 25-ГХК. Это позволило получить достаточное количество этого вещества для последующего исследования. Вскоре оно было очищено и идентифицировано как 1,25-дигидро-ксихолекальциферол (Lawson a. oth., 1969).
Испытание на стимуляцию абсорбции кальция показало, что 1,25-дигидроксихолекальциферол (1,25-ДГХК) по физиологической активности в 4—6 раз превосходит витамин Д3 и в 2—3 раза активнее, чем 25-ГХК. Вскоре этот же активный метаболит витамина Д (1,25-ДГХК) получили в лабораториях Калифорнийского и Висконсинского университетов. В митохондриях почек был выявлен специальный фермент, катализирующий окисление (Myrtle, Norman, 1971; Frolik, De Luca, 1971 и др.). Этими работами была окончательно доказана роль почек в синтезе 1,25-ДГХК. По-видимому, 1,25-дигидроксихоле-кальциферол и является той физически активной формой витамина Д в организме, которую ученые долго и упорно искали (Милосердова, 1971).
Исследованиями М. Garabedian с соавторами (1972) доказана исключительно большая роль паращитовидных желез в почечном синтезе 1,25-диоксихолекальциферола из 25-оксихолекальциферола. В эксперименте у животных с удаленными околощитовидными железами через 40 ч после тиреопаратэктомии резко снижалась выработка 1,25-ДГХК из 25-ГХК с одновременным увеличением неидентифицированного полярного метаболита Va. Введение животным 40 ед. экстракта околощитовидных желез восстанавливало синтез 1,25-ДГХК до нормы. Следовательно, этот гормон является тропином, контролирующим образование в почках гормональной формы витамина Д — 1,25-ДГХК.
Таким образом, установлено, что в организме витамин Д претерпевает ряд сложных изменений с образованием физиологически активной формы, благодаря которой осуществляется основная функция витамина Д в организме — всасывание кальция в кишечнике и его мобилизация из костной ткани.