Механизм действия пенициллина на микроорганизмы неясен. Полагают, что он нарушает ферментативные системы обмена, процессы роста, размножения.
Действие на бледную спирохету определяют как спирохетостатическое, спирохетоцидное; встречается и термин «дегенерирующее действие». Лучше всего пенициллин действует на микроорганизмы в стадии их активного размножения. В параллель с этим интересно отметить, что в клинике пенициллин гораздо эффективнее при активном, чем при скрытом сифилисе.
Существенным условием эффективного действия пенициллина на микроорганизмы является продолжительность действия. В опытах in vitro на стафилококках показано, что при действии достаточно эффективной концентрации в течение 6 часов уничтожается 95—98% всех микроорганизмов; выживает, таким образом, 2—5%. Если увеличить дозу в 100 раз, то все же не удается убить все микроорганизмы. Увеличив при первоначальной дозе в несколько раз время экспозиции, удается уничтожить микроорганизмы на все 100%. Прямые опыты показывают, что увеличение доз выше определенного предела не только не усиливает действия пенициллина, но даже снижает его. Создается, таким образом, убеждение, что для каждой инфекции in vitro существует оптимальная доза, выше и ниже которой эффект ухудшается (Гаузе). Это подтверждено и в опытах на зараженных сифилисом кроликах, так как показано, что чрезмерно высокие дозы оказывают парадоксальный эффект. Они не ускоряют, а замедляют гибель бледной спирохеты.
Весьма серьезен вопрос о возможности создания пенициллиноустойчивых штаммов бледных спирохет. Такая возможность теоретически вполне вероятна. Описаны единичные случаи клинической резистентности к действию пенициллина.