Определение преципитирующих антител проводят методом двойной диффузии в геле [Ouchterlony, 78]. Антиген (снятое молоко или его очищенные белковые фракции) помещают в центральную лунку, а исследуемую на антитела сыворотку — в периферические лунки. По мере диффузии в геле антиген и антитело взаимодействуют друг с другом, образуя комплексы, которые появляются в виде линий преципитации; каждая линия — для одного антигена и соответствующего ему антитела. Линии преципитации анализируют визуально (рис. 10). Хотя метод относительно прост, для правильной трактовки данных он требует большого опыта работы. Сопоставимые результаты можно получить лишь при тщательной стандартизации всех условий измерений, таких, как процент и количество используемой агарозы, расстояние между лунками, время инкубации, используемые положительные и отрицательные контрольные сыворотки и др. Минимальная определяемая концентрация антител IgG или IgA классов составляет приблизительно 50 мкг/мл, а антител IgM класса— 200 мкг/мл.
Рис. 10.
Множественные линии преципитации между белками сырого снятого коровьего молока в разведении 1 : 10 (центральная лунка) и антителами сыворотки крови больного с хроническим заболеванием легких, вызванным приемом молока (лунка 3). В лунках 2 и 4 нанесены сыворотки крови 2 больных с другими проявлениями аллергии. Лунки 5 и 6 содержат сыворотки крови здоровых людей без проявлений аллергии, а лунка 7 — изотонический раствор хлорида натрия.
Рис. 11. Микрослайдовая методика двойной диффузии в агаре с использованием резервуаров из плексигласа.
Чувствительность метода возрастает в 10—20 раз при использовании плексигласовых пластинок, которые позволяют исследовать большие количества антигенов в тонком слое агара (рис. 11) [79, 80]. Следует, однако, учитывать, что белки сорбируются на стенках пластинок, и, если после каждого анализа их тщательно не удалить или не соскоблить, последующие определения могут дать ложноотрицательный результат.
Согласно данным обследования детей с желудочно-кишечными кровотечениями, обусловленными приемом молока, антимолочные преципитины были обнаружены в 62% случаев; невыборочное обследование выявило наличие этих антител лишь в 1—2% случаев. Высокий титр преципитинов или множественные полосы преципитации не характерны для здоровых людей [81, 82], и их не часто обнаруживают у взрослых с аллергией к молоку [83, 84]. Вместе с тем сывороточные преципитины к белкам коровьего молока выявляются в значительном числе случаев при обследовании детей, страдающих хроническим заболеванием легких неизвестной этиологии [11, 74]. При этом, если детей, в сыворотке крови которых обнаружены преципитины, переводили на безмолочную диету, их состояние в значительном проценте случаев существенно улучшалось. Этот частный случай использования методов преципитации в агаре оказался, как показывает многолетний опыт, весьма эффективным. Тем не менее широкое использование методов преципитации для обследования детей с аллергией или даже лиц с подозрением на вызванную молоком аллергию оказалось нецелесообразным, за исключением случаев, когда симптомы болезни укладывались в картину легочного заболевания или нарушения всасывания.
При переходе на безмолочную диету титр преципитинов снижается, как правило, через 2—4 мес и может вновь возрасти до исходного уровня после приема молока [47, 85].
Титр антимолочных преципитинов повышен в сыворотке крови больных при следующих заболеваниях: энтеритах типа спру, других формах хронической диареи, железодефицитной анемии, кистозном фиброзе [8], недостаточности IgA [86—88], синдроме Дауна [43, 87, 89], семейной вегетативной дисфункции [90, 91], синдроме Вискотта — Олдрича, синдроме Гурлера и хронической рецидивирующей пневмонии [92]. Значение антимолочных преципитинов при большинстве перечисленных заболеваний остается мало понятным.
При анализе больших серий сывороток, содержащих антимолочные преципитины, и сравнении последних с контрольными линиями преципитации для 10 специфических белков коровьего молока было установлено, что в сыворотке крови, как правило, содержатся преципитины против термолабильных белков, количество которых в молоке незначительно [93]. Эти данные оказались, в известной мере, неожиданными, так как термостабильные белковые фракции, особенно бета-лактоглобулин и казеин, содержатся в молоке в значительно больших количествах. Кроме того, именно термостабильные белки считаются более сильными аллергенами у больных с нарушениями процесса всасывания в кишечнике и диареей, вызванными приемом молока.