Только значительно позже были установлены те факторы, которые подорвали доверие к терапевтическим разработкам Бэрда: нестойкость ферментных препаратов, их антигенность и недостаточная чистота применявшихся в то время экстрактов, в частности наличие в них пирогенов и токсических примесей.
Много позднее, когда были разработаны методы получения кристаллически чистых ферментов, появилась возможность вновь вернуться к их лечебному применению в более широком масштабе. Самнер в 1926 г. получил кристаллическую урсазу, Нортроп в 1930 г. — пепсин, Нортроп и Куниц — трипсин. Теперь уже можно было стабилизировать ферментные препараты и очищать их от пирогенов и других токсических веществ.
В 1934. г. Фрейнд, работавший в Вене, показал, что в сыворотке крови людей и животных в норме содержатся вещества, способные вызывать растворение раковых клеток, тогда как кровь раковых больных этим свойством не обладает. Кроме того, группа Фрейнда — Каминера обнаружила, что сыворотка крови и моча больных не только не обладают канцеролитическими свойствами, но даже предохраняют раковые клетки от растворения под действием нормальной сыворотки, т. е. содержит какой-то защитный (в отношении раковых клеток) фактор.
Если, например, к нормальной сыворотке крови добавить половинное количество «раковой» сыворотки, то первая теряет свою протеолитическую активность по отношению к раковым клеткам. Фрейнд выделил из мочи и сыворотки крови людей и лошадей активный фактор — водорастворимое термолабильное вещество; он назвал его «нормальным веществом» и использовал для парэнтеральной терапии в случаях неоперабельного рака, частично с хорошими результатами. Открытие этого явления привело также к разработке так называемого теста Фрейнда — Каминера. Этот тест основан на том, что в норме сыворотка крови людей и животных растворяет значительную часть раковых клеток в приготовленной из них свежей суспензии (позже Фрейнд использовал для этого теста клетки, убитые нагреванием) или вызывает их заметное изменение; «раковая» же сыворотка не оказывает на них практически никакого влияния и даже предохраняет их от распада под действием нормальной сыворотки. Кретц и Бенда, а также Клейн и Люстиг подтвердили эти факты. Фрейнд еще за 30 лет до этого установил, что «раковая» сыворотка обладает такого рода защитным действием, которое связано с аномальными жирными кислотами, находящимися в кишечном тракте. На основании этих исследований он рекомендовал особую диету — полное исключение животных жиров и продуктов, вызывающих брожение, а также уничтожение с помощью «кишечных антисептиков» «аномальных» (кислотоустойчивых) колибактерий, обитающих в толстой кишке у таких больных.
В 1933 г. Фрейнд и Люстиг показали, что «канцерофильный» пищевой рацион ускоряет развитие опухолей, вызываемых каменноугольным дегтем у мышей; такие животные погибают раньше, тогда как «канцерофобный» рацион защищает 50% животных от канцерогенеза. Из-за начавшейся мировой войны Фрейнд и Каминер были вынуждены прекратить свою работу и поэтому не могли установить химическую природу выделенного ими «нормального вещества». Позднее Христиани идентифицировал его как цитолитический фермент, а мы (Вольф) независимо и несколько раньше нашли, что это фермент с протеолитическим и липолитическим действием.
Христиани занимался углубленным изучением канцеролитических ферментов, и ему удалось показать, что «нормальное вещество» действительно представляет собой гидролазу, которую он назвал «растворяющим ферментом». В 1938 г. он установил, что этот фермент связан с альбуминовыми фракциями и термолабилен. Он содержится в моче и сыворотке крови здоровых людей и животных (лошадей), но отсутствует в сыворотке и моче раковых больных. Позднее Христиани обнаружил в сыворотке этих больных некоторые из ингибиторов растворяющего фермента. Они защищают от его воздействия раковые клетки, которые сами и вырабатывают их. Фрейнд тоже знал о таких ингибиторах и называл их «защитными веществами». Таким защитным действием обладают эфиры холестерина, например бутират холестерина и сукцинат холестерина; они действительно оказались идентичными ингибиторам, образуемым раковыми клетками.