17-Оксикортикостероиды в моче

17-Оксикортикостероиды в моче (определение по Портеру и Силберу в модификации М. А. Креховой). Определение ведут из суточного количества мочи. Измеряют диурез. Отбирают 50 мл мочи и доводят рН до 6,65 (по универсальному индикатору), добавляя по каплям 2 н. едкий натр или 2 н. соляную кислоту.

Из этой порции мочи отбирают в эрленмейеровские колбы две пробы по 10 мл для анализа на свободные 17-оксикортикостероиды и прибавляют к ним до 5 мл ацетатного буфера рН 4,5 (5,78 г CH3COONa · 3 Н2О растворяют в небольшом объеме воды +3,25 мл ледяной уксусной кислоты; смесь доводят до 1 л Н2О, хранят на холоду), рН буфера проверить потенциометром. Из этих же 50 мл отбирают еще две пробы по 5 мл мочи для анализа на связанные 17-оксикортикостероиды. Обе пробы помещают на плитку, прикрывают их воронками и кипятят в течение 5 минут для удаления ингибитора фермента, затем охлаждают.

К пробам, приготовленным на определение связанных оксикортикостероидов, добавляют по 5 мл ацетатного буфера и 5 мл раствора β-глюкуронидазы из расчета 1000 ЕД на 1 мл мочи (можно 500 ЕД на 1 мл). Предварительно глюкуронидазу растворяют в дистиллированной воде и по 5 мл центрифугата прибавляют к моче. Пробы мочи оставляют в термостате при температуре 37° на 16—18 часов.



На следующий день свободные и связанные 17-оксикортикостероиды экстрагируют из мочи хлороформом: в каждую колбу наливают 75 мл хлороформа (обязательно химически чистый, перегнанный из расчета пятикратного объема), встряхивают 3 минуты, оставляют нижний слой хлороформа, мочу без β-глюкуронидазы выливают, а после β-глюкуронидазы в случаях необходимости оставляют для определения фракций 17-оксикортикостероидов, связанных с серной кислотой.

Хлороформные экстракты промывают сначала 7,5 мл 0,1 н. едким натром, а затем 2,0 мл воды (трясти 1 минуту). После растворения воду удаляют, для удаления ее остатков к пробам добавляют по 2 г безводного сернокислого натрия. Встряхивают, ожидают пока раствор станет прозрачным и отливают в делительную воронку.

К опытным пробам параллельно ставят раствор стандарта и два контроля (один с фенилгидразином, другой без пего). Раствор стандарта состоит из 20 y гидрокортизона или гидрокортизона-ацетата, кортизона или кортизона-ацетата (предварительно расфасованного и выпаренного в метаноле) и 75 мл хлороформа. Контроль состоит из 75 мл хлороформа.

Из каждых двух проб мочи (с гидролизом и без него) одна служит контролем на неспецифическую окраску с одной серной кислотой. Для этого к этим двум пробам и к контролю прибавляют по 4 мл спиртового раствора серной кислоты (20 мл серной кислоты +10 мл абсолютного спирта) без фенилгидразина, а к остальным двум пробам и одному контролю и стандарту добавляют по 4 мл спиртового раствора серной кислоты с фенилгидразином.

Все пробы с фенилгидразином и без него встряхивают две минуты, ждут 10—15 минут для расслаивания, хлороформ сливают, а спиртовые растворы серной кислоты с фенилгидразином и без него собирают в пробирки. Пробирки ставят в водяную баню при температуре 60° на 30 минут, затем оставляют при комнатной температуре до следующего дня для полного развития окраски и колориметрируют. Интенсивность окраски измеряют в единицах оптической плотности при длине волны 410 миллимикрон в спектрофотометре (или ФЭКе с применением жидких фильтров). Ответ выражают в миллиграммах в сутки для свободных, для суммы свободных и связанных с глюкуроновой кислотой и связанных с серной кислотой.

Расчет ведут следующим образом: рассчитывают показания оптической плотности на 1 у гормона стандарта; от показаний оптической плотности проб с фенилгидразином вычитают показания оптической плотности проб без фенилгидразина и высчитывают содержание гормона в 5 или 10 мл мочи; зная диурез, рассчитывают суточное содержание в миллиграммах.

У здоровых людей количество свободных 17-оксикортикостероидов равно 0,13 мг/сут. (от 0,04—0,22); сумма свободных и связанных с глюкуроновой кислотой — 3,76 мг/сут. (от 1,29—0,60); связанные с серной кислотой — 0,5 мг/сут.