Электрофорез

Электрофорез — это процесс направленного движения частиц, диспергированных в жидкости в постоянном электрическом поле. Частицы одного и того же вещества несут одинаковые по знаку заряды. В электрическом поле положительно заряженные частицы перемещаются к отрицательному электроду — катоду, отрицательно заряженные частицы к положительному электроду — аноду. Движение частиц к катоду иногда называют катафорезом, к аноду — анафорезом. Скорость движения зависит от массы частиц, и их заряда в данных условиях, благодаря чему электрофорез позволяет разделять смеси веществ на составляющие их компоненты.

схема электрофореза
Рис.1.Схема свободного (фронтального) электрофореза. Положение границ раздела: а — до опыта; б — после опыта. 1 — электроды; 2 — растворитель; 3 — раствор белка.

Различают следующие виды электрофореза. 1. Свободный (фронтальный) электрофорез. В этом случае  электрофорез проводят в приборах, существенной  частью которых является U-образная трубка  (Рис. 1). Нижнюю часть трубки заполняют испытуемым объектом, например    раствором белка, на который наслаивают растворитель. В растворитель погружают электроды, соединенные с источником постоянного тока. При этом электрически заряженные частицы белка перемещаются к одному из электродов, вследствие чего граница раздела между раствором и растворителем в одном колене поднимается (восходящая граница), а в другом опускается (нисходящая граница). Приборы для свободного электрофореза, снабженные устройством автоматической регистрации перемещения каждого компонента в исследуемом объекте, применяют при анализе дисперсных систем, выделении из них отдельных компонентов, а также при клиническом исследовании сыворотки крови.



2. Электрофорез на носителях (зональный электрофорез). В качестве носителей используют бумагу, гели крахмала, агара, полиуретанов и др. В клинических лабораториях особо широкое распространение для исследования сыворотки крови получил электрофорез на бумаге, который проводится следующим образом: на полоску специального сорта бумаги, пропитанной соответствующим буферным раствором (см.), наносят капельку сыворотки крови. Концы полоски опускают в чашечки, заполненные данным буферным раствором и снабженные электродами. При пропускания постоянного электрического тока отдельные белки сыворотки перемещаются вдоль полоски с разными скоростями, а иногда и в разных направлениях. По истечении определенного времени пропускание тока прекращают, полоску бумаги подсушивают и обрабатывают реактивом на белок. При этом на бумажной электрофореграмме выявляются окрашенные пятна. По числу пятен судят о количестве белковых фракций, а по интенсивности окраски пятен — о количественном содержании каждой белковой фракции в исследуемой сыворотке.

В последнее время широкое применение в исследовательской работе и в клинической диагностике находит электрофорез в тонких слоях гелей, нанесенных на стеклянные пластинки (дисковый электрофорез), а также помещенных в стеклянные трубочки.

Электрофоретические исследования. В клинической практике применяется зональный электрофорез для исследования белкового состава жидкостей организма. Чаще используют электрофорез на бумаге как наиболее простой по технике выполнения. Электрофорез в агаровом и крахмальном гелях используется в медицинской практике преимущественно в научных исследованиях.

При помощи электрофореза на бумаге разделяют в крови фракции белков, липопротеидов, глюкопротеидов, а также белковые фракции мочи, желудочного сока, экссудатов и т. п. В крови электрофорез выявляет 5 основных фракций белка: альбумины, альфа-1 (α1) альфа-2(α2)-, бета(β)- и гамма(γ)-глобулины. В норме их соотношение более или менее постоянно. При некоторых заболеваниях эти соотношения меняются, что может иметь диагностическое и прогностическое значение. Так, например, при острых воспалительных процессах увеличивается содержание в крови α2-глобулинов; в период выработки иммунитета нарастает содержание γ-глобулинов; при поражениях печени снижается содержание альбуминов и т. п. При некоторых заболеваниях (например, при миеломной болезни) в плазме крови появляются патологические белки (парапротеины), которые могут быть выявлены с помощью методов электрофореза, что имеет большое диагностическое значение.



Электрофорез — явление направленного движения ультрамикроскопических и микроскопических частиц под влиянием приложенной извне разности потенциалов, наблюдаемое в суспензиях, эмульсиях, коллоидных растворах, растворах высокомолекулярных соединений (например, белков нуклеиновых кислот, полисахаридов и др.).

Электрофорез объясняется наличием у микроскопических и ультрамикроскопических частиц электрических зарядов, которые возникают в результате избирательной адсорбции частицами ионов из окружающей их дисперсионной среды или вследствие диссоциации ионогенных групп, входящих в состав поверхности частиц. Знак электрического заряда частицы зависит как от природы самих частиц, так и от состава дисперсионной среды. Частицы одного и того же вещества могут заряжаться как положительно, так и отрицательно при изменении состава дисперсионной среды. Так, например, макромолекулы белка в растворах, рН которых меньше изоэлектрической точки данного белка (см. Амфолиты), заряжены положительно и перемещаются в электрическом поле к отрицательному полюсу — катоду, а в растворах, рН которых больше изоэлектрической точки белка, его макромолекулы заряжены отрицательно и движутся к положительному полюсу — аноду. Движение частиц к катоду иногда называют катафорезом, к аноду — анафорезом.

Для изучения электрофореза применяют несколько методов.

Наиболее точен фронтальный электрофорез, или метод подвижной границы. Приборы, применяемые для фронтального электрофореза, разнообразны по конструкции, но каждый из них включает электрофоретическую кювету — обычно U-образную трубку (рис. 1). Нижнюю часть трубки заполняют исследуемой жидкостью, например коллоидным раствором, на который наслаивают разбавленный раствор электролита с электропроводностью, равной электропроводности коллоидного раствора. В открытые колена трубки помещают неполяризующиеся электроды, соединенные с источником постоянного тока. При включении тока коллоидные частицы единым фронтом (так как частицы в данном коллоидном растворе имеют одинаковые но знаку электрические заряды) перемещаются к одному из электродов, в результате чего граница раздела между коллоидным раствором и раствором электролита в одном колене трубки поднимается (восходящая граница), а в другом колене соответственно опускается (нисходящая граница). Перемещение границы раздела легко наблюдать, если коллоидный раствор окрашен. Если коллоидный раствор бесцветен, границу раздела между ним и раствором электролита можно сделать видимой, освещая аппарат сбоку; при этом коллоидный раствор будет опалесцировать. Иногда для этой цели используют способность коллоидных растворов или растворов высокомолекулярных соединений флюоресцировать под действием ультрафиолетовых лучей.

Рис. 1. Электрофоретическая кювета (схема): 1 — исследуемая жидкость; 2 — разбавленный раствор электролита; 3 — электроды.

Скорость U электрофоретического перемещения связана с электрокинетическим потенциалом частиц  (разность потенциалов, устанавливающаяся между границей скольжения частицы и дисперсионной средой) соотношением:
где D — диэлектрическая проницаемость дисперсионной среды, H — падение потенциала электрического поля на единицу длины, п — 3,14, η — вязкость дисперсионной среды и к — постоянная, зависящая от формы частиц (для малых сферических частиц к— С, для цилиндрических частиц к—4). Величину U/H, т. е. скорость электрофоретического перемещения частиц, рассчитанную для падения потенциала 1 в/см, называют электрофоретической подвижностью. Эта величина, имеющая размерность см2 в-1 сек-1, для белков (вблизи изоэлектрической точки) равна 0,4—0,8·10-4, для эритроцитов различных животных — 1,0—1,7·10-4 и т. п.

Совершенная техника фронтального электрофореза сложных смесей белков и других биополимеров была разработана в 1937 г. Тизелиусом (A. Tiselius). Прибор Тизелпуса и различные его модификации, дающие возможность автоматически регистрировать передвижение границы раздела каждого компонента в смеси при помощи специальных оптических устройств и особых диаграмм — электрофореграмм (рис. 2), получили широкое распространение для исследования нормальных и патологических сывороток, установления состава белковых смесей, определения чистоты белков.

Рис. 2. Электрофореграммы по Тизелиусу: 1 — нормальная сыворотка человека; 2 — плазма крови при множественной миеломе; 3 — сыворотка крови при нефрозе.

Зональный электрофорез проводится в среде какого-либо индифферентного носителя, например в гелях агара, крахмала, желатины, а также на специальных сортах фильтровальной бумаги. Особенно широкое распространение получил электрофорез на бумаге (бумажный электрофорез) при исследовании и разделении белков, нуклеиновых кислот, стеринов, аминокислот, жирных кислот и других биологически активных веществ. Электрофорез на бумаге проводится при падении потенциала порядка 15—20 В/см и силе тока 3—5 мА. Исследуемую смесь (обычно 0,01—0,04 мл раствора в буфере) наносят в виде линии на середину полоски бумаги, концы которой погружены в электродные растворы, снабженные неполяризующимися электродами. По окончании электрофореза бумагу высушивают, в случае необходимости обрабатывают специальным реактивом, окрашивающим отдельные компоненты смеси, которые образуют несколько полос в соответствии с числом компонентов. По интенсивности окраски полос электрофореграммы можно судить об относительном количестве каждого компонента в смеси.

Микроскопический метод электрофореза состоит в определении скорости передвижения в электрическом поле видимых в микроскоп частиц — бактериальных клеток, эритроцитов, частиц суспензий и эмульсий и др. Для микроэлектрофореза применяют специальные микрокюветы, снабженные электродами.

См. также Иммуноэлектрофорез.